微波技术应用于非水相酶学催化的研究进展

姜丽艳， 董洪举， 杜映达， 张爱军， 张　艳， 高　贵， 闫国栋

(吉林大学 生命科学学院，吉林 长春　130012)



·综合评述·

通信联系人：闫国栋，高级工程师，E-mail:shmily@jlu.edu.cn

微波技术应用于非水相酶学催化的研究进展

姜丽艳， 董洪举， 杜映达， 张爱军， 张艳， 高贵， 闫国栋*

(吉林大学 生命科学学院，吉林 长春130012)

摘要：综述了近年来微波辐射在非水相酶学催化方面的应用，重点介绍了微波辐射对非水相酶催化反应动力学、反应产率、选择性及酶学性质的影响。参考文献43篇。

关键词：微波辐射； 非水相反应； 酶催化； 应用； 综述

微波辐射技术是一种新型绿色的化学方法，最早被农业食品部门引入生物等领域[1]。随后，在1986年Gedye等[2]首次在有机化学反应领域使用了微波技术，开启了微波与化学合成作用的研究，并且发现微波可以有效提高化学反应速度。2002年，Bradoo[3]利用微波辅助技术建立了快速筛选脂肪酶选择性特征的方法，有效地将反应速度提高了7~12倍。随着研究的深入，Favretto等[4]将微波辐射技术和非水相酶学催化方法相结合，偶然发现微波技术不仅可以提高非水相反应的反应速率，而且增强了酶的稳定性和选择性。继此令人兴奋的科学发现后，微波辐射技术和酶催化方法作为生物合成领域中的两大催化手段已获得广泛关注。

微波是介于红外辐射光波和无线电波间的一种电磁波谱，频率为300 MHz~300 GHz，波长1 m~1 mm，具有吸收、反射和穿透三个基本性质[5]。酶是一种高效催化剂，具有催化速率快、位置选择性高和反应条件温和等特点。酶在非水介质中能催化在水中不能进行的反应，增加了水不溶性底物酶促催化转化的范围。报道显示将微波辐射和非水相酶催化偶联使用能改善酶活性中心和底物的诱导和契合作用，提高反应体系的反应速度、增强酶催化的专一性[6]。目前，研究人员们致力于该方面的研究，并越来越多地关注微波对非水相酶催化反应动力学和酶特性的影响。

本文综述了近年来关于微波技术偶联非水相酶催化方面的研究进展，探讨了微波技术在非水相酶催化领域的潜在应用价值。重点介绍了微波辐射对非水相酶催化反应动力学、反应产率、选择性及酶学性质的影响。

1微波效应

目前用于微波反应研究的主要是频率为2.45 GHz，波长为12.2 cm的民用微波[7]。微波对化学反应的影响主要有“致热效应”与“非热效应”[8]。

致热效应主要是利用微波的辐射特性对物质和反应进行加热，是微波对酶催化反应加热的理论基础。其原理是当生物样品如水、蛋白质及脂肪等极性物质在微波高频电磁场的作用下，反复快速的改变取向从而发生快速的转动，通过分子间摩擦和碰撞将动能和微波能转化为热能，快速提高反应体系温度[9]。与常规加热相比，微波加热具有传导和极化两种机制，致使微波加热具有其独特的性质。微波加热属于内源性加热，不需要传导和对流，介质内、外部同时被加热，所以微波加热可以将能量直接传至反应物的官能团部位，具有快速加热，且全面、均匀的特点[10]。另外，微波可以选择性加热物质，物质的介电常数愈大，对微波的吸收作用越强。如水等极性介质，对微波有很强的吸收能力，也能被快速均匀的加热；对于各种气体等非极性介质，微波对其没有加热作用[11]。

非热效应主要是由微波的化学效应和电磁效应引发的致热效应以外的效应，即指当微波辐射具有提高反应速度、改变立体选择性、减少副反应等无法单纯用致热效应解释的其它效应[12]。目前，非热效应的机理尚未研究清楚，但推测反应机理主要是微波电场对分子的极化作用，使分子自身原有的电子排列状态发生微小变化；另外，微波可能引起分子的震动导致化学键的断裂，或因微波的选择性加热使物质的活性增加[13]。

2微波加热对非水相酶促反应的影响

2.1　微波加热对非水相酶促反应初速度的影响

经过近十年的研究，微波技术在非水相酶催化反应中的作用已经被认同，且得到了广泛的应用。微波辐射能够改善酶的“微环境”，增强酶的活性中心和底物的诱导作用，有效提高非水介质中酶促反应初速度。2005年，Lin等[14]在有机相中使用固定化脂肪酶435催化合成脂肪酸酯，发现在微波加热条件下，反应初速度比传统加热模式提高了2.63倍。Bradoo等[3]利用不同的脂肪酶进行甘油酯的催化水解反应，发现微波辐射比常规加热条件下反应初速度提高了7~12倍。2012年，Yadav等[15]利用微波辐射和Novozym 435转酯4,8-二甲基-7-烯-1醇时，反应初速度提高了2.3倍。随着研究的深入，有人提出在微波辅助非水相酶催化反应的过程中，反应初速度受诸多因素的影响，首先是反应体系的水活度。适量的水能使酶活性中心的极性和柔性提高，进而加快反应速率，但过量的水则会改变酶活性中心的结构，导致酶活力降低。1996年，Parker等[16]研究了非水相溶剂中丁醇与乙酸乙酯的转酯催化反应，结果发现，当水活度(aw)为0.58和0.69时，微波辐射可以使酶的初始反应速度提高2~3倍，而当aw增加至0.97时，反应初速度反而明显下降，且低于传统加热模式。Huang等[17]使用固定化酶催化有机相酯化反应，也发现仅体系的水含量为0.5%~8%(V/V)时，微波照射能够使酶的初始反应速度提高1.5倍。同时，Lin等[14]发现在使用微波加热时，反应体系的水含量为0.05%~0.5%(V/V)，酶促反应的初始速度提高了2.1~4.7倍。另外，在微波加热时，非水相介质的极性也影响着酶促反应的初速度。2002年，Goswami等[18]在枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的催化反应中，分别使用了六种不同的非水相反应溶剂，结果发现在使用不同的有机溶剂时，微波加热可以使反应初速度提高2.1~4.7倍不等，而且反应初速度随溶剂的LogP值增加而增大(苯为溶剂时除外)。Yadav和Lahi[19]研究了脂肪酶在甲苯中的转酯反应，也发现随着介质疏水性增加，反应初速度随之增加。2007年，江南大学刘诗雨[20]研究了脂肪酶催化辛酸和丁醇、辛酸和甘油的酯化反应体系，发现正辛烷为溶剂时，微波加热时的反应初速度值比常规加热下初速度值高。当以直链烷烃同系物和芳烃同系物作溶剂时，反应初速度与溶剂的碳链长度有关。同时，在微波加热条件下，微波处理方式也直接影响着非水相酶催化的反应初速度。Zhu等[21-22]发现当用微波预辐射同时结合碱处理时，反应初速度较微波预辐射和先碱处理再微波预辐射的处理方式效果明显。影响非水相酶催化反应的因素还包括反应温度、pH值、载体和酶及缓冲液的浓度等。非水相酶催化的反应环境复杂，每一个影响因素都会对反应速度产生直接的影响。分析其原因发现，酶促反应初速度的提高是源于微波辐射使底物的形态发生改变使其更易于与酶活性中心结合[23-24]。

2.2　微波加热对非水相酶促反应产率的影响

微波辐射对非水相酶促反应产率的影响主要基于微波功率、微波时间、反应体系和酶种类及酶所处的微环境变化，且反应产率的增加和反应速度的提高是并存的。适宜的微波辐射功率和时间，能使酶分子活性中心的结构更加“裸露”，更好地与底物结合。早在1996年，Pujie等[25]在研究微波辅助酶催化反应时，发现在最佳的微波辐射条件下反应产率明显高于常规加热模式。随后，Vacek等[26]利用微波辐射辅助酶选择性酯化合成脂肪酸酯，产率较常规加热增加了1.1～1.9倍。蔡汉成[27]于2004年研究了戊醇的同分异构体和辛酸为底物的非水相酶催化酯化反应，结果发现微波辐射可以明显提高反应产率。随着研究的深入，Matos等[28]采用统计学分析方法研究了微波温度，微波功率和微波时间对PCL特性的影响，发现微波温度是影响PCL特征的关键因素，且使用微波辐射时，产率要明显高于传统加热方式。Yu等[29]在酶促产乳糖的研究中，发现微波辅助加热16 h，果糖产率为45%，而当用传统加热24 h时，果糖产率仅为43%。最近，江苏科技大学孙国霞[30]考察了微波辐射效应对酶催化芦丁选择性水解产异槲皮苷的酶促效率的影响，结果发现在最佳的微波辐射和反应体系下芦丁的转化率为89.18%、异槲皮苷产率为84.74%，和传统加热模式相比，反应效率分别提高了大约120倍。2014年，Shinde等[31]也发现，在微波辐射下，MCPA的酯化反应初速度提高了2倍，产率达到了83%。大量研究表明，适宜条件的微波辐射作用可以一定程度的增强酶的催化活性，提高有机相中酶促反应产率。

2.3　微波加热对非水相酶促反应选择性的影响

微波辐射作用于蛋白质等极性分子，迫使反应向生成某一构型产物方向进行。同时，酶结构中具有催化活性的基团分子与底物分子发生瞬间的作用，经过诱导契合作用激活反应底物。Carrillo-Munoz等[32]研究了脂肪酶催化1-苯基乙醇的手性拆分，发现脂肪酶在微波加热条件下，显著提高了底物的亲和性和选择性，产物的ee值分别提高了2.6倍和4.9倍。随后，Lin等[33]利用脂肪酶(PPL)催化1,2,3,4-四氢化-1-萘酚和1-茚满醇的酰化反应，发现在微波辐射下，脂肪酶对应选择性分别提高了3~9倍和7~14倍。Zarevúcka等[34]利用葡萄糖基转移作用酶促合成吡喃葡萄糖苷和半乳葡萄糖苷时，与传统加热模式相比，明显提高了酶催化的区域选择性。蔡汉成[27]在微波辐射酶耦合催化效应的研究中发现，微波辐射能够使酶的选择性提高58.85%，同时指出经微波辐射后，酶活性中心的立体结构和相关底物基团的诱导和定向作用增强，使底物分子参与反应的基团与酶活性中心更加接近，从而提高酶催化的选择性专一性。另外，也有学者提出，通过微波辐射，能够降低反应的活化能，进而提高酶的专一性和选择性[3,16,27,35]。

2.4　微波加热对酶的形态、结构和活性的影响

酶几乎不溶于有机溶剂，在有机溶剂中呈悬浮状态，致使酶催化反应形成了一个非均相反应体系。利用超声波处理可以减小酶颗粒，提高酶的分散度，有利于形成均相反应体系，从而增加酶反应速度。微波辐射对酶结构和活性的影响与微波辐射的条件及酶所处的微环境密切相关。Procelli等[36]通过研究微波辐射对S-腺苷高半胱氨酸水解酶结构的影响，指出微波辐射的非热效应引起了蛋白质结构的重排。随后，夏咏梅等[37]对比了相同温度下经微波辐射预处理过的酶液和经常规热处理的酶液荧光强度变化，发现酶的蛋白部分经微波辐射后更加“裸露”，进而引起了酶活的增加。Chen等[38]利用微波辐射处理植物种子子叶中的淀粉酶、转氨酶和蛋白酶，发现在适宜的微波辐射下，酶的稳定性比常规加热条件下的酶稳定性更高，且当底物的极性较强时，微波辐射则更具优势。但Procelli等[36]却发现微波辐射下酶的失活速率较常规加热下大；而且Cara等[39]指出微波辐射β-半乳糖苷酶时，酶活仅是常规加热下的20%。 Soysal等[40]发现脂肪酶Novozym 435在有机介质中的稳定性也会受到微波辐射的影响。所以当采用不同的微波辐射温度、时间和功率时，微波辐射发挥着正负不同的催化效应。分析原因可能是微波的高频电场会引起酶蛋白的β-折叠增加，α-螺旋紊乱，使蛋白质结构变得无序化。适度裸露的酶蛋白分子便于与底物的定向结合，从而加快反应速度，提高反应产率和增强酶的选择性；但酶蛋白的过度裸露会引起酶结构过于松散，破坏酶的立体构象，致使酶活性下降，增大竞争性副反应的发生[41-43]。

3结论

微波辐射作为一种新型、绿色和安全的加热能源已经被广泛的应用于非水相酶催化领域，且在医药、生物化学和食品工业等生产、科研领域发挥了巨大的作用。微波辅助非水相酶催化不仅可以加快化学反应速率，提高化学反应产率，而且还能改变酶催化反应的选择性和专一性。但是有机溶剂对酶活及酶稳定性仍然存在一定的负面影响，且微波温度、微波功率和微波时间及反应体系等复杂的条件均会对非水相酶催化引起不同的正负效应。所以微波技术应用于非水相酶催化的研究是一项系统艰巨的工程，还需要引入更先进、更精细的研究手段和方法，积累更多的实验数据和实验现象，进一步建立相应的微波辐射影响非水相酶结构及反应动力学模型，从而明确微波辐射影响非水相酶催化的相关机理和作用机制，为加快工业化进程奠定坚实基础。

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Research Progress on Application of Microwave Irradiation

in Non-aqueous Enzymatic Catalysis

JIANG Li-yan,DONG Hong-ju,DU Ying-da,

ZHANG Ai-jun,ZHANG Yan,GAO Gui,YAN Guo-dong*

(College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China)

Abstract：Research progress on application of microwave irradiation in non-aqueous enzymatic catalysis were reviewed with 43 references. The influence of microwave irradiation on enzyme catalytic reaction kinetics, reaction yields, selectivity and enzymology properties in organic solvent were discussed in detail.

Keywords：microwave irradiation; non-aqueous reaction; enzymatic catalysis; application; review

中图分类号：Q814; O643.3

文献标志码：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.01.15341

作者简介：姜丽艳(1983-)，女，汉族，吉林松原人，博士研究生，主要从事酶催化研究。E-mail:jiangliyan@jlu.edu.cn

基金项目：“985工程”学科及平台/基地建设项目

收稿日期：2015-10-08