烷基二苄醚双季铵盐的杀菌性能研究*

朱海林， 胡志勇， 王建龙， 曹端林

(中北大学 化工与环境学院， 山西 太原 030051)



烷基二苄醚双季铵盐的杀菌性能研究*

朱海林， 胡志勇， 王建龙， 曹端林

(中北大学 化工与环境学院， 山西 太原 030051)

摘要:合成了3种烷基二苄醚双季铵盐10-B-10， 12-B-12和14-B-14， 考察了其对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)悬液的定量杀菌效果. 结果表明， 所研究的新型双季铵盐具有广谱的杀菌能力， 杀菌性能随着表面活性剂浓度的增加而增加. 随着疏水碳链长度的变化， 所研究的3种烷基二苄醚双季铵盐表面活性剂表现出不同的杀菌性能， 其中12-B-12的杀菌活性最高， 且其最低抑菌浓度(MIC)值远低于N,N-二甲基十二烷基苄基氯化铵(1227)的MIC值.

关键词:阳离子Gemini表面活性剂； 大肠杆菌； 枯草芽孢杆菌； 最小抑菌浓度

0引言

季铵盐表面活性剂具有抑菌、 杀菌的功能， 且毒性低， 应用范围广， 对其作为杀菌剂的研究已有较长的历史. 但微生物对季铵盐易产生抗药性， 长期使用， 会使得药效不断下降， 投放量不断增加， 生产成本逐年上升， 且造成环境污染[1-3]， 因此， 寻找新型的杀菌剂具有重要意义. 阳离子型Gemini表面活性剂由于其临界胶束浓度cmc值比普通表面活性剂低1～2个数量级， 且具有更大头基正电荷密度和疏水链密度[4]， 有望作为新一代高效杀菌剂来代替传统的单链杀菌剂.

Gemini表面活性剂是利用连接基团将两个常规的单链表面活性剂在其亲水基部位或靠近其亲水基部位通过化学键连接在一起形成的两亲性分子[5-6]. 由于在分子中引入了连接基团， 克服了传统表面活性剂由于离子头基之间的电荷斥力或水化引起的分离倾向， 使得Gemini表面活性剂具有许多优异的物化性能和应用性能. Gemini表面活性剂的的诸多优异性能皆源于其特殊的分子结构， 其中将两个亲水基连接在一起的连接基起了关键的作用， 并且已经成为学者关注的焦点[7]. 根据Gemini表面活性剂的连接基团结构的刚柔性可以将其分为柔性基团、 刚性基团以及半刚性基团[8]. 目前对于Gemini表面活性剂的杀菌性能也有一些文献报道， 但主要集中在柔性结构的连接基上[9-10]， 较少涉及刚性或半刚性连接基团. 本文以自制的含半刚性连接基的双烷基二苄醚双季铵盐为杀菌剂， 考察其对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的杀灭效果， 为开发这一类新型结构的表面活性剂在杀菌消毒领域的应用提供理论依据.

1实验部分

1.1试剂和仪器

1.1.1实验试剂

烷基二苄醚双季铵盐， 实验室自制[11]， 分子结构如下采用元素分析， FTIR(KBr压片)和ESI-MS对合成的3种烷基二苄醚双季铵盐表面活性剂进行了结构表征.

10-B-10 元素分析结果(测定/理论)： C 60.23/59.82， H 9.84/9.76， N 3.65/3.88； IR(KBr,σ/cm-1)： 3009， 2926， 2855， 719； ESI-MS： m/z 281.27142 [M-2Br]2+.

12-B-12 元素分析结果(测定/理论)： C 61.82/61.68， H 10.13/10.09， N 3.51/3.60； IR(KBr,σ/cm-1)： 3016， 2925， 2848， 721； ESI-MS： m/z 309.30240 [M-2Br]2+.

14-B-14 元素分析结果(测定/理论)： C 63.42/63.29， H 10.49/10.38， N 3.23/3.36； IR(KBr,σ/cm-1)： 3012， 2925， 2853， 722； ESI-MS： m/z 337.33445 [M-2Br]2+.

枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)， 大肠杆菌(ATCC 8099)； 牛肉膏， BR， 北京奥博星生物科技有限责任公司； 蛋白胨， BR， 北京奥博星生物科技有限责任公司； 琼脂粉， BR， 国药集团化学试剂有限公司； 氯化钠， AR， 天津市恒兴化学试剂制造有限公司.

1.1.2实验仪器

PHS-25C数显酸度计， 上海宇隆仪器有限公司； 立式压力蒸汽灭菌器， 01J2003-04型， 上海东亚压力容器制造有限公司； 生化培养箱， SPX-10013-Z型， 上海博迅实业有限公司医疗设备厂； 净化工作台， SW-CJ-1FD型， 苏州净化设备有限公司； 数显水浴恒温振荡器， SHA-B型， 金坛市三和仪器有限公司； 培养皿， 9 cm， 河间市五一玻璃工艺制品厂； 移液枪， 大龙兴创实验仪器(北京)有限公司.

1.2杀菌性能测试方法

1.2.1琼脂培养基的配制

称取蛋白胨10.0 g， 牛肉膏5.0 g， 氯化钠5.0 g， 加蒸馏水1 000 mL溶解， 调pH至7.0～7.2， 然后加入琼脂粉20.0 g加热溶解， 分装， 于121 ℃压力蒸汽灭菌20 min后备用.

将培养皿用牛皮纸包裹， 于121 ℃压力蒸汽灭菌20 min. 然后将灭完菌的琼脂培养基趁热倒入无菌培养皿中， 待琼脂凝固后， 翻转培养皿， 置于培养箱中， 备用.

1.2.2无菌水的制备

将蒸馏水分装在18 mm×180 mm的试管中以及250 mL三角瓶中， 塞上棉塞， 用牛皮纸把管口封好， 于121 ℃压力蒸汽灭菌20 min后备用.

1.2.3菌液制备

取冻干菌种， 在无菌操作下打开， 以毛细吸管加入适量营养肉汤， 轻柔吹吸数次， 使菌种融化分散. 取含营养肉汤培养基5.0～10.0 mL试管， 滴入少许菌种悬液， 置34 ℃培养18～24 h. 用接种环取适量的菌悬液， 划线接种于琼脂培养斜面上， 于34 ℃培养箱内培养18～24 h. 置于4 ℃ 冰箱内保藏， 备用.

使用时取冷藏的菌种斜面于34 ℃培养箱中活化3～4 h. 用10 mL无菌水冲洗生长良好的活化斜面， 并用接种针全部刮下倒入预先灭完菌的无菌水中， 置于34 ℃摇床培养18～24 h， 每次实验原菌液的菌落数为1×107～9×107cfu/mL.

1.2.4杀菌液制备

在杀菌剂使用的当天， 称取一定质量的Gemini表面活性剂， 在无菌室内均匀摊开， 在紫外灯下灭菌30 min， 在无菌条件下， 溶解于事先灭好菌的无菌水中.

1.2.5杀菌剂杀菌性能测试

把实验用的无菌培养基、 9 mL无菌稀释水、 无菌吸管等用品放入洁净操作台内， 打开紫外灯灭菌30 min.

将培养好的菌液放入灭完菌的洁净操作台内， 用75%乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉擦手， 点燃酒精灯.

在原菌液中加入一定量的Gemini表面活性剂溶液， 置于34 ℃摇床培养1 h后， 采用10倍稀释法稀释菌液， 即用1 mL无菌吸管吸取1 mL菌液注入到9 mL空白稀释水中， 充分摇匀； 用另一支1 mL无菌吸管吸取1 mL菌液注入到9 mL空白稀释水中， 充分摇匀； 以此类推. 用0.1 mL无菌吸管吸取3个稀释度的菌液， 涂布于有无菌培养基的平皿内， 每个稀释度作两个平行， 于34 ℃培养箱内培养18～24 h， 计数， 测定不同浓度Gemini表面活性剂存在下的菌落数. 同时取不加杀菌剂的菌液的菌落数作对照.

杀菌率的计算公式为

(1)

式中： Ⅰ是对照样品的平均菌落数； Ⅱ是加入杀菌剂的样品的平均菌落数.

2结果与讨论

2.1表面活性剂用量与杀菌活性的关系

以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌， 考察所制备的双烷基二苄醚双季铵盐的杀菌能力， 其杀菌率对表面活性剂浓度的关系曲线如图 1， 图 2 所示.

图 1　表面活性剂对大肠杆菌的杀菌率Fig.1　Antimicrobial activity of synthesized surfactants against E. coli

图 2　表面活性剂对枯草芽孢杆菌的杀菌率Fig.2　Antimicrobial activity of synthesized surfactants against B. subtilis

如图 1 和图 2 所示， 所合成的双烷基二苄醚双季铵盐对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)以及革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)均有较好的杀灭效果， 说明所合成的新型双季铵盐Gemini表面活性剂具有广谱的杀菌性能. 从图中还可以看到， 无论是大肠杆菌还是枯草芽孢杆菌， 随着表面活性剂用量的增加， 其杀菌率均增加. 这主要是与表面活性剂的杀菌机理有关[12]： 由于细菌表面带负电荷， 所合成的双烷基二苄醚双季铵盐属于阳离子型表面活性剂， 其带正电荷的离子头基可吸附在细菌的细胞壁上， 产生室阻效应， 导致细菌生长受抑而死亡； 或通过渗透和扩散作用， 穿过细胞表面进入细胞膜， 阻碍细胞膜的半渗透作用， 并进一步穿入细胞内部， 使细胞酶钝化， 蛋白质酶不能产生， 从而使蛋白质变性， 达到杀死细菌细胞的作用. 表面活性剂的浓度增加， 使得其头基的正电荷密度增加， 从而增强了杀菌效果.

2.2表面活性剂结构与杀菌活性的关系

从图 1 和图 2 可以看出， 无论是对大肠杆菌还是枯草芽孢杆菌， 相同表面活性剂浓度时， 10-B-10的杀菌率都最低， 杀菌性能最差， 其原因在于10-B-10的疏水链长度较短， 疏水性能较差， 与细胞的类脂层结合较弱， 插入同样疏水环境的细胞膜能力差， 因而杀菌活性较低. 在这3种表面活性剂中， 14-B-14的疏水链最长， 表面活性最高[13]， 但是其杀菌性能却低于12-B-12. 其原因在于细菌的细胞中的磷脂分子多数含12个碳原子， 当Gemini表面活性剂的正电荷头基吸附在带负电荷的细胞壁后， 其疏水尾链可以插入到细胞膜内疏水的类脂层. 根据空间位阻效应和相似相容原理， 与细菌细胞的类脂层含相同碳原子数Gemini表面活性剂与其物理化学性质最相似， 空间匹配性最好， 所需的结合能量最小[14]. 另一种被广泛接受的解释是， 阳离子表面活性剂的杀菌性能与其HLB值相关， 当疏水链碳原子数大于12后， 继续增加疏水链的长度， 将会导致疏水性太强而阻碍其穿透细胞膜[15]. 同时， 疏水链长增加同样会导致表面活性剂在水中的溶解度降低， 进而降低其杀菌活性.

2.3表面活性剂的最小抑菌浓度(MIC)

最小抑菌浓度(MIC)是杀死90%以上的细菌所需杀菌剂的浓度， 可以用来衡量杀菌剂的活性. MIC值越低， 表明杀菌剂的活性越高[16]. 表 1 列出了所合成的新型Gemini表面活性剂和杀菌剂N,N-二甲基十二烷基苄基氯化铵(1227)的MIC值.

表 1　各种杀菌剂对大肠杆菌和

从表 1 可以看出， 10-B-10的MIC值最高， 杀菌活性最低， 12-B-12的MIC值最低， 杀菌活性最高. 对于疏水链碳原子数同为12的12-B-12和1227， 12-B-12的MIC值为13 mg/L， 远低于1227的MIC值(50 mg/L)， 说明所合成的Gemini表面活性剂的杀菌性能明显优于相应的单链表面活性剂1227， 其原因在于由于连接基的存在， Gemini表面活性剂分子内带正电荷的离子头基相距被拉近， 单个表面活性剂分子中正电荷密度增加， 从而表现较高的杀菌活性. 另外， Gemini表面活性剂有两条疏水烷烃链， 疏水性能更强， 与细胞类脂层的疏水结合作用更强， 也导致了较强的杀菌效果[18].

3结论

本文研究了所合成的新型双烷基二苄醚双季铵盐的杀菌性能， 所研究的双季铵盐表面活性剂对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都有较好的杀菌性能； 随着碳链长度的变化双季铵盐表面活性剂表现出不同的杀菌性能， 其中当双季铵盐表面活性剂的碳链长度为12时具有最好的杀菌效果， 即12-B-12的杀菌效果最好， 并且比现用的杀菌剂1227具有更好的杀菌能力.

参考文献:

[1]白义珍. 克拉玛依油田回注地层水杀菌剂的再次筛选[J]. 油田化学, 1994, 11(3): 247-249.

Bai Yizhen. Bactericidal treatment of formation water for reservoir flooding by newly selected bactericides[J]. Oilfield Chemistry, 1994, 11(3): 247-249.(in Chinese)

[2]段明峰, 梅平, 孙永, 等. 新型缓蚀杀菌剂双季铵盐在油田中的应用[J]. 石油化工腐蚀与防护, 2005, 22(2): 11-14.

Duan Mingfeng, Mei Ping, Sun Yong, et al. Application of a new bactericide - dual quaternary ammonium salt in oil field[J]. Corrosion & Protection in Petrochemical Industry, 2005, 22(2)： 11-14.(in Chinese)

[3]孟琳, 周丽萍, 葛双启, 等. 双季铵盐杀菌剂的合成及其杀菌性能研究[J]. 化学工程师, 2005, 115(4)： 59-60.

Meng Lin, Zhou Liping, Ge Shuangqi, et al. Preparation of the double-quaternary ammonium salt and the evaluation of its bactericidal performance[J]. Chemical Engineer, 2005, 115(4)： 59-60.(in Chinese)

[4]赵剑曦, 毛宁, 游毅, 等. 季铵盐Gemini表面活性剂杀菌活性及其与分子结构的关联[J]. 应用化学, 2003, 20(12)： 1208-1210.

Zhao jianxi, Mao Ning, You Yi, et al. Bactericidal activities of some quaternary Gemini surfactants in relation with their molecules structures[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2003, 20(12)： 1208-1210. (in Chinese)

[5] Menger F M, Keiper J S. Gemini surfactants[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2000, 39(11)： 1907-1920.

[6]Zana R. Dimeric (Gemini) surfactants： effect of the spacer group on the association behavior in aqueous solution[J]. Journal of Colloid Interface Science, 2002, 248(2)： 203-220.

[7]赵剑曦. Gemini 表面活性剂： 联接链在自组织中的作用及意义[J].化学进展, 2014, 26(8)： 1339-1351.

Zhao Jianxi. Gemini surfactants： role and significance of its spacer in self-assembly[J]. Progress in chemistry, 2014, 26(8)： 1339-1351.(in Chinese)

[8]Zhu D Y, Cheng F, Chen Y, et al. Preparation, characterization and properties of anionic Gemini surfactants with long rigid or semi-rigid spacers[J]. Colloid and Surface A, 2012, 397： 1-7.

[9]Kuperkar K, Modi J, Patel K. Surface-active properties and antimicrobial study of conventional cationic and synthesized symmetrical Gemini surfactants[J]. Journal of Surfactant and Detergent, 2012, 15(1)： 107-115.

[10]Brycki B, Szulc A. Gemini alkyldeoxy-D-glucitolammonium salts as modern surfactants and microbiocides： synthesis, antimicrobial and surface activity, biodegradation[J]. Plos one, 2014, 9(1)： 1-5.

[11]朱海林, 胡志勇, 王建龙, 等. 烷基二苄醚双季铵盐的合成及在水溶液中的聚集行为[J]. 精细化工, 2013, 30(12)： 1374-1378.

Zhu Hailin, Hu Zhiyong, Wang Jianlong, et al. Synthesis and aggregation properties of alkyl dibenzyl ether quaternary ammonium in aqueous solution[J]. Fine Chemicals, 2013, 30(12)： 1374-1378.(in Chinese)

[12]王艳. 新型两性离子型Gemini表面活性剂的制备及性能研究[D]. 天津： 天津大学, 2010.

[13]Zhu Hailin, Hu Zhiyong, Wang Jianlong, et al. Synthesis and properties of alkyl dibenzyl ether quaternary ammonium Gemini surfactant[J]. Tenside Surfactants Detergents, 2015, 52(2)： 163-169.

[14]Kanazawa A, Ikeda T. Multifunctional tetracoordinate phosphorus species with high self-organizing ability[J]. Coordination Chemistry Reviews, 2000, 198(1)： 117-131.

[15]Zhong Xing, Guo Jianwei, Fu Shuqin, et al. Synthesis, surface property and antimicrobial activity of cationic Gemini surfactants containing adamantane and amide groups[J]. Journal of Surfactant and Detergent, 2014, 17： 943-950.

[16]Kuperkar K, Modi J, Patel K. Surface-active properties and antimicrobial study of conventional cationic and synthesized symmetrical Gemini surfactants[J]. Journal of Surfactant and Detergent, 2012, 15： 107-115.

[17]Tatsumi T, Imai Y, Kawaguchi K, et al. Antimicrobial activity of cationic Gemini surfactant containing an oxycarbonyl group in the lipophilic portion against gram-positive and gram-negative microorganisms[J]. Journal of Oleo Science, 2014, 63(2)： 137-140.

[18]毛学强, 何帅, 李君, 等. 季铵盐双子表面活性剂的合成及其杀菌性能研究[J]. 合成化学, 2011, 19(2)： 180-183.

Mao Xueqiang, He Shuai, Li Jun, et al. Synthesis and antibacterial properties of quaternary ammonium Gemini surfactants[J]. Chinese Journal of Synthetic Chemistry, 2011, 19(2)： 180-183.(in Chinese)

Antimicrobial Activities Research of Alkyl Dibenzyl Ether Biquaternary Ammonium

ZHU Hai-lin， HU Zhi-yong， WANG Jian-long， CAO Duan-lin

(School of Chemical and Environmental Engineering， North University of China， Taiyuan 030051， China)

Abstract:Three kind of alkyl dibenzyl ether biquaternary ammonium (10-B-10，12-B-12，14-B-14) were synthesized，and their antimicrobial activities were examined by the suspension quantitative germicidal test to Gram positive(Escherichia coli) and Gram negative(Bacillus subtilis). The results show that the new biquaternary ammonium which we have researched has broad bactericidal performance. The antimicrobial activities increase with the increasing concentration of the Gemini surfactants, various bactericidal properties were showed up from the alkyl dibenzyl ether biquaternary ammonium Gemini surfactants based on the length hydrophobic carbon chain. 12-B-12 has the best bactericidal activities. Compared with benzalkonium chloride (1227), the MIC value of 12-B-12 is much lower.

Key words:cationic Gemini surfactants; Escherichia coli; Bacillus subtilis; minimal inhibitory concentration

中图分类号:O647.2

文献标识码:A

doi:10.3969/j.issn.1673-3193.2016.01.009

作者简介：朱海林(1982-)， 女， 讲师， 博士， 主要从事表面活性物质的合成及性能研究.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21406211)； 中北大学自然科学基金

*收稿日期:2015-07-12

文章编号:1673-3193(2016)01-0039-05