胡萝卜籽蛋白的提取工艺优化及性质研究

户 佩， 胡海峰， 胡 磊， 汪少芸， 洪 晶， 胡春凤

(1．福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2．新干三湖中学， 江西 吉安 331303)

胡萝卜籽蛋白的提取工艺优化及性质研究

户 佩1， 胡海峰1， 胡 磊1， 汪少芸1， 洪 晶1， 胡春凤2

(1．福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2．新干三湖中学， 江西 吉安 331303)

以胡萝卜籽为原料， 采用碱提酸沉法对其中的蛋白质进行提取. 通过单因素实验考察料液比、 温度、 pH值和时间对蛋白质提取率的影响， 在此基础上通过正交实验优化出胡萝卜籽蛋白提取的最佳工艺条件， 确定了胡萝卜籽蛋白最佳酸沉pH值， 并对所提取的蛋白质功能性质进行了研究. 结果表明： 在料液比为 1 ∶20、 温度55 ℃、 pH值为12.0、 时间4 h 的条件下, 胡萝卜籽蛋白的提取率为 42.23%, 最佳酸沉 pH值为4.5, 吸水性为3.28 g· g-1， 吸油性为 3.09 mL· g-1， 乳化性和起泡性相对较差.

胡萝卜籽蛋白； 提取工艺； 碱提酸沉法

0 引言

胡萝卜籽为伞形科胡萝卜属胡萝卜(DaucuscarotaL var sativa DC)的干燥成熟的种子， 化学成分丰富， 含有蛋白质、 黄酮、 油脂、 胡萝卜甾醇以及一些人体必需的微量元素等[1]， 是一种传统中药. 胡萝卜籽具有广泛的生理活性， 如抗氧化、 止痛、 消炎、 抗菌、 降血脂、 抗肿瘤和抗尿结石等[2]， 因而具有极高的研究价值和开发前景.

目前， 国内外有关胡萝卜籽的研究主要集中在胡萝卜籽油、 胡萝卜素、 黄酮类等[3-5]， 而对胡萝卜籽蛋白的研究尚无相关报道. 植物种子中蛋白质含量高， 蛋白氮素营养丰富， 胆固醇和脂肪含量低， 且能够为人体提供某些必需氨基酸， 对于人体健康有非常重要的作用[6]. 人们已逐渐认识到对植物种子蛋白的开发利用具有广阔的前景， 也有很多学者对植物种子蛋白源进行了相关研究， 如洪晶等[7]对韭菜籽蛋白, 王姝等[8]对羽扇豆分离蛋, 张涛等[9]对汉麻籽蛋白及熊家艳等[10]对黔江肾豆蛋白的提取和研究. 因此， 以胡萝卜籽为研究对象， 通过正交试验优化胡萝卜籽蛋白的提取工艺， 并对胡萝卜籽蛋白性质进行研究， 提高其附加价值， 对其它植物种子资源的开发利用也具有一定的指导意义.

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

胡萝卜籽(购于福州市种子市场)； 考马斯亮蓝G-250(上海生物工程有限公司)； 牛血清白蛋白(BSA)(国药集团化学试剂有限公司).

1.2 主要仪器与设备

TH2-82型水浴恒温振荡摇床(金坛市鸿科仪器厂)； EU2600型紫外-可见分光光度计(上海昂拉仪器有限公司)； FE20型精密pH 计(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)； KDN-102C定氮仪(上海纤检仪器有限公司)； FD-1C-50型真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)； XZ-21K高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司).

1.3 实验方法1.3.1 胡萝卜籽蛋白提取工艺方法

胡萝卜籽→粉碎→过250 μm筛→浸提→离心分离→上清液→酸沉→离心分离→蛋白沉淀→冷冻干燥→胡萝卜籽蛋白粉

1.3.2 胡萝卜籽蛋白含量测定

通过凯氏定氮法测定胡萝卜籽总蛋白含量， 考马斯亮蓝法(Bradford法)测定浸提液中蛋白质含量， 则提取率的计算公式为：

(1)

式中：Y为蛋白质提取率(%)；ρ为提取液蛋白的质量浓度(mg·mL-1)；V为提取液体积(mL)；w为胡萝卜籽粉中蛋白的质量分数(%)；m为胡萝卜籽粉的取样质量(mg).

1.3.3 单因素实验设计

在浸提步骤中， 影响蛋白质提取率的主要因素有浸提液pH值、 料液比、 浸提温度和时间. 准确称取一定量的胡萝卜籽粉末样品， 以蛋白质提取率为指标， 选择这4个因素作为考察对象， 对各因素选取不同水平做单因素实验， 提取步骤参照1.3.1， 提取率的计算依照公式(1)所示.

表1 正交试验因素水平Tab.1 Factors and levels in the orthogonal design

1.3.4 正交实验优化胡萝卜籽蛋白浸提工艺

在取得单因素实验结果后， 选择对蛋白提取率影响较大的3个因素， 采用L9(34)正交实验设计， 进行3因素3水平正交实验， 确定胡萝卜籽蛋白提取最佳工艺条件， 实验安排如表1所示.

1.3.5 胡萝卜籽蛋白最佳酸沉pH值的测定

取蛋白提取液， 平均分成5份， 用1 mol·L-1HCl调节pH值分别为3.5、 4.0、 4.5、 5.0和5.5， 4 ℃下静置0.5 h后10 000 r·min-1下离心10 min， 取上清Bradford法测定其蛋白质量浓度， 则上清液中胡萝卜籽蛋白残留率最少(即上清液在595 nm下吸光值最低)的浸提液pH值即为最佳酸沉pH值.

1.3.6 胡萝卜籽蛋白功能性质的测定

1) 吸水性. 称取 0.1 g 蛋白质样品， 加入 5 mL 去离子水， 充分振荡1 min后常温下静置0.5 h， 4 000 r·min-1下离心0.5 h， 去除分离水， 测定残留物的质量. 以每克蛋白样品(干质量)吸附水的克数来表示其吸水性：

(2)

式中： WA表示吸水性(g·g-1)；m1为离心分离后残留物质量(g)；m为蛋白质干质量(g).

2) 吸油性. 称取0.1 g蛋白样品于刻度离心管中， 加入4 mL食用油， 在振荡器上振荡混匀1 min后室温静置0.5 h， 4 000 r·min-1下离心0.5 h， 测量离心后游离油的体积， 除去游离油的体积即为蛋白质样品的吸油量. 以每克蛋白样品(干质量)吸油的毫升数来表示其吸油性：

(3)

式中： OA表示吸油性(mL·g-1)；V为4 mL；V1为游离油体积(mL)；m为蛋白质干质量(g).

3) 乳化性及乳化稳定性. 称取1.2 g 蛋白质样品溶于20 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol·L-1、 pH 7.0)中， 加入20 mL 食用油， 10 000 r·min-1条件下均质2 min， 均质液平分成2份， 1份在1 500 r·min-1转速下离心10 min， 测定乳化层高度， 则蛋白质的乳化能力按如下公式计算：

(4)

式中： EA表示乳化性(%)；h为乳化层高度(cm)；H为离心管中液体总高度(cm).

将另一份样品静置于80 ℃水浴锅中， 保温0.5 h， 待冷却至室温， 在1 500 r·min-1转速下离心10 min， 测量此刻样品乳化层的高度， 则蛋白质的乳化稳定性按如下公式计算：

(5)

式中： ES表示乳化稳定性(%)；h1为静置30 min后乳化层高度(cm)；h为乳化层高度(cm).

4) 起泡性及起泡稳定性. 称取0.5 g蛋白质样品置于pH值为8.05的0.05 mol·L-1Tris-HCl 缓冲溶液中定容至20 mL. 调节pH值至7.0， 再通过高速搅拌器均质2 min， 立刻转入50 mL 量筒中， 并用少许蒸馏水清洗搅拌器， 记录均质停止时的泡沫体积， 计算公式如下：

(6)

式中： FA表示起泡性(%)；V1为均质停止时泡沫及液体总体积(mL)；V为均质前总体积(mL).

记录均质0.5 h后泡沫的体积， 以此衡量样品泡沫的稳定性.

(7)

式中： FS表示泡沫稳定性(%)；V2为静置30 min后泡沫体积(mL)；V3为均质停止时泡沫体积(mL).

2 结果与讨论

2.1 胡萝卜籽蛋白含量测定结果

采用凯氏定氮法测得胡萝卜籽中总蛋白含量为(23.57±0.14)%.

2.2 单因素试验结果及分析2.2.1 料液比对胡萝卜籽蛋白提取率的影响

在pH值为10.0、 温度45 ℃、 时间4 h 条件下， 按料液比 1 ∶10、 1 ∶20、 1 ∶30、 1 ∶40 和 1 ∶50分别提取胡萝卜籽蛋白， 测定胡萝卜籽蛋白提取率. 结果如图1所示， 胡萝卜籽蛋白提取率在料液比为1 ∶10 到 1 ∶20 之间逐渐增加； 在1 ∶20到1 ∶40之间， 提取率无显著变化； 当料液比大于1 ∶40后， 随料液比的增加, 提取率开始下降. 料液比的变大可以促进蛋白质在溶液中的溶出率， 但当料液比超过一定比例后， 蛋白提取率反而略有降低， 这可能是因为胡萝卜籽中含有的膳食纤维具有较强的吸水膨胀能力， 导致蛋白样品与浸提液之间的流动性变差， 搅拌不均所致[11-12]. 因而选择浸提液的最佳料液比为1 ∶20.

2.2.2 浸提液 pH 值对胡萝卜籽蛋白提取率的影响

固定料液比1 ∶20、 温度45 ℃、 提取时间4 h， 在 pH 值分别为 8.0、 9.0、 10.0、 11.0和12.0的条件下进行浸提， 结果见图2 . 由图2可以看出， 当浸提液的pH值逐渐变大时， 提取率先上升后不变， 且在pH值为11.0时到达最高， 说明在碱性环境下特别是pH值为11.0时提取效果最好， 但是随pH值继续增大， 提取率没有显著性变化. 党斌等[13]在对春油菜菜籽蛋白提取工艺优化的结果中得知， pH值对菜籽蛋白提取率影响达极显著水平， 最优浸提液pH值为12. 考虑到过碱会消耗更多盐酸, 因此选择提取液最佳pH值为11.0.

2.2.3 浸提温度对胡萝卜籽蛋白提取率的影响

在pH值为10.0、 料液比1 ∶20、 时间4 h， 温度分别为25、 35、 45、 55和 65 ℃的条件下对胡萝卜籽蛋白进行提取， 结果见图3. 由图3可知， 提取温度从25 ℃增大至45 ℃过程中， 提取率显著提高； 温度大于45 ℃后提取率迅速降低. 洪晶等[7]对韭菜籽蛋白浸提温度因素研究中发现， 温度从4 ℃上升到50 ℃过程中蛋白提取率显著增加， 但当温度超过50 ℃时蛋白提取率迅速下降. 这种现象的出现可能是因为温度提高破坏了蛋白质的空间三维结构， 使得蛋白质变性沉降， 溶液中蛋白质含量减少， 故而选择最佳浸提温度为45 ℃.

2.2.4 浸提时间对胡萝卜籽蛋白提取率的影响

在pH值为10.0、 料液比为 1 ∶20、 温度为45 ℃的条件下， 对胡萝卜籽蛋白分别进行1、 2、 3、 4和5 h的提取. 结果如图4所示， 蛋白提取率随提取时间的增加而升高， 在提取时间到达4 h时， 提取率达到最大， 而后蛋白提取率随时间的增加有所降低. 宋鹏等[12]对大豆分离蛋白浸提时， 发现随着浸提时间的增加蛋白提取率升高， 当提取率达到最大时， 继续延长提取时间， 蛋白提取率变化不大. 王姝等[8]在对羽扇豆蛋白提取时， 也发现到达某个时间点后随着浸提时间的增加蛋白得率达到了动态平衡. 说明浸提时间的进一步增加并不能更有效地提高蛋白提取率， 且浸提时间越长耗能越大， 因此选取的最佳浸提时间为4 h.

2.3 正交实验优化蛋白提取工艺结果及分析

综合单因素实验结果， 选取料液比、 pH值和温度作为考察对象， 研究其对提取率的影响. 实验结果如表2所示， 方差分析见表3.

表2 提取工艺正交试验结果Tab.2 Orthogonal array layout and experimental results

注：T表示总和

表3 正交试验方差分析表Tab.3 Orthogonal experimental analysis of variance of extraction

注: ** 表示P< 0.01；e表示误差项

由表2正交实验的极差结果分析可知，RB>RA>RC， 各个因素主次影响顺序：B>A>C， 即 pH值>温度>料液比. 从表3方差分析的结果可知， 因素A、B、C对试验指标的影响都是高度显著的. 结合直观分析和方差分析可以得出最优组合为：A3B3C2， 即温度55 ℃、 pH12.0、 料液比1 ∶20. 在此最优条件下进行3次验证试验， 得胡萝卜籽蛋白提取率为42.23%， 符合正交实验结果.

2.4 胡萝卜籽蛋白最佳酸沉pH值的确定

蛋白质分子在溶液中会产生解离， 依据溶液pH值的不同， 解离后所带的电荷也不同， 当蛋白质等电点与溶液pH值相同时， 蛋白质分子解离产生的正、 负电荷相等(即蛋白质分子所带的净电荷为零)， 此时蛋白质分子会发生凝聚而产生沉淀. 因此， 蛋白质在等电点时溶解度最小， 最易形成沉淀物[14]. 依据这一原理， 测得胡萝卜籽蛋白等电点为4.5(见图5).

表4 胡萝卜籽蛋白质的功能性质Tab.4 Functional properties of carrot seeds protein

2.5 胡萝卜籽蛋白功能性质测定结果

针对胡萝卜籽蛋白的吸水性、 吸油性、 起泡性及泡沫稳定性、 乳化性及乳化稳定性作了研究, 实验结果如表4所示.蛋白质对水吸附能力的大小可以通过吸水性或持水性来判断. 从表4可以看出， 胡萝卜籽蛋白具有较好的吸水性， 若利用胡萝卜籽蛋白较好的持水能力， 将其应用到食品中， 可以保证食品的口感和多汁程度. 蛋白质的吸油性影响了食物的风味， 吸油性高的蛋白质在处理过程中脂肪的损耗较少， 可以改善食品的风味和可口性. 胡萝卜籽蛋白的吸油性优于南瓜籽蛋白和蚕豆蛋白[15-16]， 因而可以考虑作为一种蛋白质类添加剂将其应用于食品中.

蛋白质分子含有亲油和亲水性基团， 可与水、 脂肪等多相体系中的分子相互作用， 因此在油水混合体系中可以形成油水乳化液， 这种形成油水乳化液的能力以及保持这种乳化液稳定的能力就是蛋白质的乳化性和乳化稳定性. 由表 4 可知， 胡萝卜籽蛋白乳化性只有38.82%， 相比其他植物蛋白来说较小， 但其乳化稳定性却可以达到70.41%， 这可能是因为胡萝卜籽蛋白与多糖之间形成了一种聚合物， 发生了美拉德反应， 因而具有较好的乳化稳定性[13].

蛋白质在受到剧烈的搅拌时， 外界大量的空气会进入从而形成泡沫， 同时蛋白质可被吸附到气泡表面， 构成一个有一定弹性和刚性二维保护的薄膜， 因此只有可溶性蛋白参与泡沫的形成[17]， 从表4可知, 胡萝卜籽蛋白的起泡性很低， 而形成的泡沫在4 min左右即消失， 基本不具有泡沫稳定性， 这是因为蛋白质的起泡性与其溶解性有很大关系. 赵敏等[11]在对核仁蛋白的溶解性研究中发现， 温度对核仁蛋白的溶解性有较大影响， 在温度为20～30 ℃范围内核仁蛋白溶解性不高. 推测胡萝卜籽蛋白在此温度下溶解性不好， 故而导致其起泡性和泡沫稳定性较差.

3 结论

1) 以胡萝卜籽为原料， 通过料液比、 温度、 pH值、 时间单因素实验和三因素三水平正交实验， 确定了影响胡萝卜籽蛋白提取率的各因素主次顺序为： pH值 >温度>料液比. 结合直观分析和方差分析得出最优组合为：A3B3C2， 即温度55 ℃、 pH12.0、 料液比1 ∶20. 在此最优条件下， 测得蛋白质实际提取率是 42.23%. 实验结果为胡萝卜籽蛋白的提取提供了良好的实验基础.

2) 胡萝卜籽蛋白的溶解度随pH值 变化呈V型曲线， 在pH值为4.5时蛋白溶解度最小， 以此确定了胡萝卜籽蛋白最佳酸沉pH 值为4.5， 这与多数植物蛋白相似.

3) 对胡萝卜籽蛋白的部分功能性质研究发现， 胡萝卜籽蛋白的吸水性、 吸油性分别为3.28 g·g-1和3.09 mL·g-1， 起泡性、 乳化性分别为17.67%和38.82%， 泡沫稳定性基本为零， 但是乳化稳定性较好. 有关胡萝卜籽蛋白的凝胶性、 溶解性等其他功能特性及其在乳制品、 配方食品、 饮料中的实际应用效果还有待进一步研究.

[1] 刘睿婷. 胡萝卜子化学成分分析及指纹图谱[D]. 乌鲁木齐： 新疆大学, 2012.

[2] 宋立人, 王锦鸿. 中华本草-维吾尔药卷[M]. 上海： 上海科学技术出版社, 2005.

[3] YU L L, ZHOU K K, PARRY J. Antioxidant properties of cold-pressed black caraway, carrot, cranberry, and hemp seed oils[J]. Food Chemistry, 2005, 91(4)： 723-729.

[4] MILADI S, JARRAYA R, DAMAK M. Lipid composition and antioxidant activities ofDaucusmaritimusseeds[J]. Journal of Applied Sciences, 2008, 8(24)： 4 689-4 693.

[5] KUMARASAMY Y, NAHAR L, BYRES M,etal. The assessment of biological activities associated with the major constituents of the methanol extract of wild carrot (DaucuscarotaL.) seeds[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy, 2005, 5(1)： 61-72.

[6] 韩宝达, 李立新. 植物种子贮藏蛋白质及其细胞内转运与加工[J]. 植物学报, 2010, 45(4)： 492-505.

[7] 洪晶, 陈涛涛, 唐梦茹, 等. 响应面法优化韭菜籽蛋白质提取工艺[J]. 中国食品学报, 2013, 13(12)： 89-96.

[8] 王姝, 王昌涛, 于国萍. 羽扇豆蛋白的提取及性质研究[J]. 食品科技, 2012, 37(5)： 230-235.

[9] 张涛, 卢蓉蓉, 钱平, 等. 汉麻籽蛋白的提取及性质研究[J]. 食品与发酵工业, 2008, 34(8)： 173-179.

[10] 熊家艳, 邓利玲, 范超敏, 等. 黔江肾豆蛋白质提取工艺优化及其功能性质研究[J]. 食品科学, 2012, 33(18)： 25-31.

[11] 赵敏, 周欢, 姜忠丽, 等. 桃仁蛋白的提取及功能性质研究[J]. 农产品加工, 2014 (14)： 42-44

[12] 宋鹏, 魏安池, 周瑞宝, 等. 不同工艺条件对大豆分离蛋白提取率的影响[J]. 中国油脂, 2011, 36(2)： 16-19.

[13] 党斌, 杨希娟, 孙小凤, 等. 春油菜菜籽蛋白的提取工艺优化及性质研究[J]. 油脂工程·技术, 2010, 29(5)： 29-32.

[14] 张民, 王婵, 毕华, 等.裸燕麦麸皮蛋白的提取工艺及理化性质研究[J]. 现代食品科技, 2012, 28(11)： 1 495-1 499.

[15] 褚云鸿, 周美华, 李全, 等. 胡萝卜籽挥发油的抗生育作用[J]. 生殖与避孕, 1985, 5(1): 37-40.

[16] 李雪琴, 苗笑亮, 裘爱泳. 蚕豆分离蛋白的制备及其功能性质研究[J]. 粮食与饲料工业, 2003(5)： 41-43.

[17] 肖连冬, 程爽, 李杰. 大豆分离蛋白起泡性和乳化性影响因素的研究[J]. 中国酿造, 2014, 33(4)： 83-86.

(责任编辑： 洪江星)

Optimization of extraction process and properties of protein from carrot seed

HU Pei1, HU Haifeng1, HU Lei1, WANG Shaoyun1, HONG Jing1, HU Chunfeng2

(1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China;2. Sanhu Middle School of Xingan, Ji’an, Jiangxi 331303, China)

In the present study, carrot seed protein (CSP) was extracted from carrot seeds by alkali-solution and acid-isolation. The effects of material-to-liquid ratio, pH, extraction temperature and time on the extraction rate of CSP were explored by single factor experiments. The best precipitation pH and the functional properties of CSP were also determined. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows that ratio of solid to liquid 1 ∶20, pH 12.0, extraction temperature 55 ℃, extraction time 4 h. Under these conditions, extraction rate of CSP was 42.23%. The best pH value of CSP precipitation was 4.5. The water absorption was 3.38 g· g-1, and the oil absorption was 3.09 mL· g-1, while the emulsifying capacity and the foaming capacity were relatively weak.

carrot seed protein; extraction technology; alkaline extraction-acid precipitation method

10.7631/issn.1000-2243.2016.05.0732

1000-2243(2016)05-0732-06

2015-03-10

洪晶(1981-)， 副教授， 博士， 主要从事食品生物技术方面的研究, jhong@fzu.edu.cn

福建省科技厅资助项目(2013J05050)

Q51

A