miR-34家族抑制肿瘤作用的研究进展

陈晨，王欣，沈兴家（1.江苏科技大学生物技术学院　江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室，江苏　镇江　212018；2.中国农业科学院　蚕业研究所，江苏　镇江　212018）



miR-34家族抑制肿瘤作用的研究进展

陈晨1，2，王欣1，2，沈兴家1，2
（1.江苏科技大学生物技术学院江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室，江苏镇江212018；2.中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江212018）

[摘 要]miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，广泛分布于节肢动物、线虫纲动物以及哺乳动物中。最近研究发现，miR-34家族可通过多种途径参与肿瘤、心血管疾病和衰老相关信号转导网络的调控，与肿瘤、心血管疾病和衰老的发生、发展密切相关。本文对miR-34家族在上述领域中的功能研究进行综述。

[关键词]microRNA；miR-34；肿瘤；心血管疾病；衰老；综述文献

MicroRNA（miRNA）是一类短的内源性单链非编码RNA分子，长约18～24个核苷酸。miRNA基因在进化中高度保守，可以与靶mRNA的互补区域部分结合，并阻碍他们的表达或翻译。第一个miRNA基因lin-4是由Lee等[1]通过遗传分析方法在线虫中发现的，该基因通过与靶基因lin-14的3′UTR相互作用而抑制lin-14蛋白的表达。通过大量研究证明miR-34与肿瘤[2]、心血管疾病[3]和衰老[4]的发生发展有重要关系。本文主要针对miR-34家族对肿瘤抑制作用的功能研究进行综述，以揭示其在肿瘤调控过程中的重要作用。

1　miR-34家族

miR-34于2001年在线虫中被首次发现[5]，广泛分布于节肢动物、线虫纲动物和哺乳动物中。miR-34家族在进化上非常保守，从低等生物到人类均存在单一保守的同源识别序列。高佳莉等[6]研究显示，miR-34基因从无脊椎动物到脊椎动物的发展进化与其他基因家族类似，发生了基因的串联重复和局部重复，从而形成了miR-34家族。

2　miR-34家族的功能

2.1miR-34家族与肿瘤的发生 miR-34家族在抑制多种肿瘤（神经母细胞瘤、肝癌、消化道癌、乳腺癌、肺癌、直肠癌等）的发生过程中起到重要作用。miR-34的过表达会导致细胞凋亡、细胞周期停滞、细胞衰老、抑制肿瘤细胞的再生及迁移。研究显示，miR-34家族的调控涉及到多个靶基因、靶蛋白或信号通路[7]，其中包括：CDK4/6，E2F3，E2F5，cyclin E2，MET，Bcl-2，SIRT1，Myc，Notch，CD44，原癌基因c-myc等。miR-34家族主要是通过以下生物学效应发挥抑制肿瘤的作用。

2.1.1促进肿瘤细胞凋亡：细胞凋亡是在特定时空中发生的、受机体严密调控的细胞“自杀”现象。恶性肿瘤的发生与凋亡调控机制失常导致凋亡受阻有重要关系。在肿瘤发生和发展过程中，细胞不仅发生了异常增殖，发生凋亡的能力和倾向均有所降低。

研究显示，miR-34家族可参与调控肿瘤细胞的凋亡过程。Notch参与多种细胞信号通路，包括分化、增殖、细胞凋亡、黏附、上皮间质转录、迁移和血管再生[8]，Notch是miR-34的靶基因之一，miR-34可通过调控Notch参与肿瘤细胞的凋亡。Li等[9]首次对Notch与miR-34在胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤中的关系进行了研究，结果显示miR-34a同时下调了Notch-1和Notch-2的表达。此外，在宫颈癌中miR-34a可调控Jagged-1及Notch-1的表达，降低肿瘤细胞的侵入能力[10]，促进细胞凋亡。miR-34除了通过调控Notch外还可通过其他途径参与肿瘤细胞的凋亡。有研究显示，miR-34c能明显抑制II型子宫内膜癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，同时，细胞凋亡能进一步抑制细胞增殖及细胞克隆形成，因此认为miR-34c是II型子宫内膜癌的潜在抑癌基因[11]。Chang等[12]在结肠癌HCT116细胞中发现，分别在野生型p53细胞、p53缺失型细胞以及对照组中转染miR-34a，其结果显示含野生型p53细胞诱导的凋亡明显高于其他组别，因此推测p53可诱发miR-34a参与细胞凋亡过程。

2.1.2抑制肿瘤细胞增殖与分化：肿瘤的发生是一个多步骤、多因素、多阶段和多基因改变的过程，其中细胞增殖失控和细胞周期调控失常被认为是肿瘤发生的重要机制。研究显示，miR-34家族可参与抑制肿瘤细胞的增殖与分化过程。c-Kit是CD117或干细胞因子受体，它属于受体酪氨酸激酶第三亚类。白血病、胶质母细胞瘤、黑素瘤、肺癌和乳腺癌的发生可激活c-Kit。有研究显示，miR-34与c-Kit 的mRNA作用可抑制c-Kit的表达，从而抑制癌细胞的增殖[13]。LMTK3属于LMTK蛋白激酶家族中的一员，它是一个重要的雌激素受体（ERα），同时也是miR-34a的一个靶标，它参与细胞增殖和细胞周期进程。有研究用雌激素对ERα阳性乳腺癌细胞系MCF-7进行处理，miR-34a的表达下调[14]，通过构建慢病毒载体对miR-34a进行表达，可下调LMTK3和Akt磷酸化，同时双荧光素酶报告基因检测结果得出miR-34a的过表达使LMTK3的mRNA及其蛋白水平下降，因此推测miR-34a通过调控LMTK3的表达水平，抑制乳腺癌细胞的增殖。Musashil1（Msi1）是一个进化上保守的RNA结合蛋白，它与多种肿瘤有关系，如人脑胶质瘤[15]、髓母细胞瘤、宫颈癌、肺癌和结肠癌。它可以在细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡和分化过程中抑制一些特殊基因的表达，从而对miR-34a进行负调控。Msi1的3'UTR是几个肿瘤抑制miRNA的靶基因，其中包括miR-34a。加入miR-34a的重组细胞其表现为Msil表达的减少，以及细胞增殖的减少[16]。此外，在间皮细胞中转染miR-34抑制剂会导致细胞增殖，这一结果可能是通过上调CMET、C-MET磷酸化和Bcl-2蛋白实现的[17]，因此推测，miR-34家族可以通过c-Kit、LMTK3、Msi1、C-MET、C-MET磷酸化和Bcl-2等参与抑制肿瘤细胞的增殖与分化。

细胞周期是指细胞从上一次分裂结束开始生长到下一次分裂终止所经历的过程。细胞周期中的间期细分为G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、M期（细胞有丝分裂后期）。肿瘤细胞周期的特点是细胞群主体分布于DNA合成活跃的S期[18]。研究显示，miR-34家族可参与阻滞肿瘤细胞周期[19]。在骨肉瘤细胞U-2OS中转染miR-34a引起G1期阻滞，转染pri-mir-34a 6 d后，克隆形成明显减少；在肺癌细胞中转染miR-34a，48 h后通过流式分析检测到亚G1期DNA增加，而S期和G2/M期下降，说明凋亡增加。这些实验说明miR-34具有促进细胞周期停滞、抑制细胞增殖的作用。此外，马丽萍等[20]发现miR-449b和miR-34c可使高恶性卵巢癌细胞系SKOV3-ipl发生细胞周期阻滞，并且下调细胞周期相关蛋白CDK6、CDC25A和CyclinA的表达水平。由此可见，miR-34可参与细胞生长阻滞过程，抑制细胞增殖及克隆形成，使细胞周期发生阻滞，对于抑制肿瘤细胞生长有重要意义。

2.1.3抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移：肿瘤细胞从原发部位侵袭迁移到远处器官，是癌症患者死亡最常见的原因，肿瘤侵袭与迁移的基本步骤是通过原发瘤增殖，侵袭毗邻的基底膜和细胞外基质，再穿入血管或淋巴管随血流或淋巴液到达并停留于远位的微血管或淋巴管中，接着穿出血管或淋巴管，最后在特定组织或器官中形成转移灶[21]。

研究显示，miR-34家族可参与抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移过程。淋巴细胞鸟嘌呤核苷酸分解抑制剂（lymphocyte guanine nucleotide dissociation inhibitor，LyGDI）属于受鸟苷酸解离抑制因子（guanine nucleotide dissociation inhibitors，GDIs），LyGDI是调控Rho鸟苷三磷酸酶与Rac1、Rac3 和CDC42的非活性区域结合的重要调控因子，LyGDI可通过抑制Rho蛋白的生物活性抑制肿瘤侵袭和迁移[22]。Duan等[23]通过生物信息学预测软件Targetscan预测、RT-PCR和蛋白表达研究得出LyGDI 是miR-34a的一个靶基因，miR-34a的异常表达可以下调LyGDI的表达水平，从而促进Rac1激活以及膜转位，大幅降低环氧酶2的表达，在非小细胞型肺癌中恢复辐射诱发的细胞凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭和迁移。Axl是酪氨酸蛋白激酶受体，它参与癌细胞的增殖迁移和侵袭[24]。在三阴性乳腺癌细胞（缺乏雌激素受体、黄体酮受体、人类表皮生长因子受体）MDA-MB-231中转染miR-34a，结果发现Axl受体的表达受到抑制。在转染了miR-34a的癌细胞中观察到Akt磷酸化下降以及表型的改变，荧光素酶报告基因检测结果证实Axl的3’UTR为miR-34a与之结合的一个靶位点[25]。此外，pre-mir-34a的转染，在体外可抑制癌细胞迁移和侵袭，在体内可减少远距离肺转移瘤或肝转移瘤的数量[26]。除此之外，研究显示，在骨肉瘤[27]、宫颈癌、绒膜癌[10]和肝癌[28]中，miR-34a的过表达可下调C-MET致癌基因的表达，同时抑制癌细胞扩散。在肝癌细胞中，过表达miR-34a可以抑制C-MET的mRNA水平和蛋白水平，从而降低C-MET介导的细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）的磷酸化水平，参与抑制肝癌细胞的侵袭和迁移[28]，同样在骨肉瘤中miR-34a可能通过调控靶基因C-MET抑制骨肉瘤细胞的生长和迁移[27]。miR-34b、miR-34c、miR-199a可以抑制原癌基因MET的表达，通过antagomiRs抑制这些内源miRNA的表达可上调MET蛋白的表达水平，反之在癌细胞中外源表达这些miRNA可阻断MET介导的信号转导及侵袭过程[29]。在葡萄膜恶性黑素瘤中[30]，miR-34a可以直接或间接下调C-MET、p-Akt及其他细胞周期相关蛋白的表达，从而抑制肿瘤的生长和迁移。可见，miR-34主要通过调控LyGDI、Axl、c-Myc、C-MET等靶基因的表达参与抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，对肿瘤的发生发展可能起到抑制作用。

2.1.4增强免疫监视：免疫系统具有识别、杀伤并及时清除体内突变细胞，防止肿瘤发生的功能。免疫监视是免疫系统最基本的功能之一，免疫监视功能过低会导致肿瘤的形成。

miR-34家族通过抑制ULBP2[31]，增强免疫监视，进而发挥抑癌作用。自然杀伤细胞受体NKG2DL存在于肿瘤细胞的表面，能使肿瘤细胞对NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞变得敏感，使其逃避免疫监视。ULBP2是人类恶性黑素瘤的预后标志物，受miR-34a/c和miR-449a/c的调控。生物信息学分析，这些miRNAs直接靶向ULBP2 mRNA的3'UTR区域。在黑色素瘤细胞中转染miR-34a能大幅降低ULBP2的表达和增强NK细胞介导肿瘤细胞识别[32]，从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和清除。

2.2miR-34家族的其他功能

2.2.1miR-34家族与心血管疾病的发生：miR-34参与血管新生、血管内皮衰老、动脉粥样硬化以及心肌细胞凋亡和心室重构等过程。研究显示，在内皮祖细胞中，miR-34a可抑制SIRT1的表达，调控内皮细胞的衰老，而阿托伐他汀可通过抑制miR-34a从而上调SIRT1的表达，发挥其改善血管内皮功能的作用[33]。此外，过表达miR-34a会抑制内皮祖细胞的体内血管新生功能，研究者在老年小鼠（18～20月龄）内皮祖细胞中转染miR-34a inhibitor抑制miR-34a的表达，在年轻小鼠（8周龄）中转染miR-34a mimic过表达miR-34a，结果显示，在老年小鼠内皮祖细胞中的血管新生能力显著升高，而在年轻小鼠内皮祖细胞中的血管新生能力显著下降[34]。在老龄鼠心肌内可以检测到多种miRNA的表达上调，其中上调最显著的是miR-34家族，在老年小鼠中用antagomir-34a抑制miR-34a的表达可减少心肌细胞的凋亡，急性心肌梗死后沉默miR-34a可改善心肌的恢复能力。此外，对急性心肌梗死模型小鼠进行antagomir-34a治疗14 d后，小鼠心脏的射血分数和心室壁运动相关参数均有改善，同时，该研究发现了几个新的miR-34a靶蛋白，其中PNUTS的下调最为显著。体外实验已证实，PNUTS的高表达会阻碍依赖miR-34a的细胞凋亡、端粒缩短以及心肌细胞的功能障碍等过程[35]。

2.2.2miR-34家族与衰老：衰老是随着时间推移，生物体的结构和机能逐渐趋于老化、衰退的复杂生物学过程。有研究显示miR-34与衰老具有重要联系，在多种衰老细胞中，miR-34的表达存在异常[36]。

Bai等[37]研究发现了几个与线粒体调控衰老相关的miRNAs，如miR-34a和miR-335，它们在肾脏系膜细胞衰老过程中表达上调，分别下调TXNRD2和SOD2的表达量，从而引起线粒体中的活性氧自由基水平升高，导致肾细胞衰老。Liu等[38]研究发现，miR-34在果蝇中调节衰老和神经退行性病变，果蝇中的miR-34的表达呈现出老年化、脑组织富集性表达和不同年龄的表达差异性等特点，miR-34功能缺失的果蝇出现脑组织加速衰老、脑退化甚至是生存能力急剧下降。然而，过表达miR-34可减缓由人类致病性多聚谷氨酰胺蛋白引起的果蝇脑组织神经退行性病变，进而延长果蝇的寿命。Boon等[39]研究发现在老化的心脏中会诱导产生miR-34a，如果对其进行体内沉默或基因敲除都会使衰老相关的心肌细胞死亡率降低。同时，抑制miR-34a的表达可提高急性心肌梗死细胞的存活率，并降低急性心肌梗死后细胞死亡和纤维化的发生率，促进心肌功能恢复。

3　结语

近年来关于miR-34家族的研究不断增多，其作用机制也不断被揭示，人们逐渐认识到miR-34家族在肿瘤发生过程中发挥着重要作用，不仅如此，其表达异常也可导致除肿瘤外的其他疾病，如心血管疾病等。因此，将miR-34家族与传统的研究成果相结合，可为肿瘤及其他疾病的研究提供更为广阔的天地，也为研究miR-34家族在肿瘤中的诊断和治疗提供新的思路和途径。鉴于miRNA的特性，通过调节其表达抑制肿瘤的生物学行为是目前肿瘤治疗的新策略，在miR-34的表达受到抑制或下调的情况下，可通过合成miR-34类似物，增加miR-34的表达，达到治疗作用。或在miR-34异常表达导致病变时，可利用反义寡核苷酸直接结合miR-34阻断其活性，从而发挥治疗作用。

总之，miR-34通过调控多个靶基因广泛参与肿瘤的发生发展。对肿瘤的早期诊断、治疗以及预后具有重要的作用，但在其临床应用前仍然需要更深入的研究和探索。

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（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

·读者·作者·编者·

通信作者：沈兴家，研究员，博士生导师，Email：shenxjsri@ 163.com。

作者简介：陈晨（1988-），女，云南昆明人，硕士生。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31172266）；江苏省研究生培养创新工程项目（CXZZ12-0726）。

收稿日期：2015-03-26

[中图分类号]R73

[文献标志码]C

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.021