基于ITS2序列的中药材桔梗种子DNA条形码鉴定＊

刘金欣，潘 敏，张改霞，赵春颖，石林春，＊＊

（1. 承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室 承德 067000；2. 济南市妇幼保健院 济南 250001；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

基于ITS2序列的中药材桔梗种子DNA条形码鉴定＊

刘金欣1，潘 敏2，张改霞3，赵春颖1，石林春1，3＊＊

（1. 承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室 承德 067000；2. 济南市妇幼保健院 济南 250001；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

目的：桔梗为中国常用大宗药食兼用中药材，种植面积广，建立基于DNA条形码技术的桔梗种子鉴定方法具有重要意义。方法：本研究共收集29份中药材桔梗基原植物和种子样品；利用体式显微镜、X射线影像工作站观察种子的形态特征及种子成熟度；优化DNA提取方法；基于中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）和《中国药典中药材DNA 条形码标准序列》对种子物种进行鉴定。结果：不同群体来源或同一群体来源桔梗种子形态特征存在较大差异，识别困难；本实验可以实现单粒桔梗种子（约1mg）的DNA提取、PCR扩增和序列测定；5份样品同一群体内种子ITS2序列存在差异；中药材DNA条形码鉴定系统和《中国药典中药材DNA 条形码标准序列》可以作为种子物种鉴定的依据。结论：DNA条形码分子鉴定法可以对中药材桔梗种子进行鉴定，同时为中药材种质资源鉴定提供了新方法，对中药材种子质量标准的建立提供依据。

桔梗 种子 形态特征 DNA条形码 鉴定

据2015版中国药典记载，中药桔梗为桔梗科多年生草本植物桔梗Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.的干燥根[1]。桔梗为中国常用大宗药材品种之一，性苦、辛，平，归肺经，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓等功效，主治咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑、肺痈吐脓等症[2]。近年来，桔梗市场需求量大，野生资源已不能满足需求。中国自上世纪70年代起开始栽培桔梗，目前已形成山东淄博，安徽亳州、太和，内蒙赤峰3大道地产区，山东省沂源县三岔乡GAP种植区生产的栽培桔梗已占据商品桔梗市场的主导地位[3]。桔梗是一种药食两用的中药材，已列入卫计委药食同源食品目录，为朝鲜族的传统食物，在中国东北地区和韩国大量使用，其主要活性成分是皂苷，该类成分属五环三萜衍生物，具有抗炎、祛痰、镇咳、抗溃肠及抗肿瘤、降血压、扩张血管、解热镇痛、镇静、保肝、降血糖、抗胆碱、促进胆酸分泌、抗氧化与美容、抗过敏及增强人体免疫力等多种药理活性[4-7]。

DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA 序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充，已广泛用于中药材（包括药材及部分药材饮片）及基原物种的鉴定，特别是名贵珍稀濒危中药的鉴定，如冬虫夏草、石斛等[8-11]。陈士林等建立的全球中药材DNA条形码数据库，已涵盖中国、日本、韩国、印度、欧盟、美国等6国药典的几乎所有草药品种，将中草药鉴定从形态鉴定发展到DNA鉴定水平，被称为中草药鉴定的文艺复兴[12]。辛天怡等将DNA 条形码技术与二维码（QR Code）技术相结合，建立中药材二维DNA条形码流通监管体系，实现对中药材流通的数字化监管[13]。此外，应用DNA条形码技术对“超级食品”枸杞子和红景天饮片的鉴定，将DNA条形码分子鉴定法扩展到药食同源中药材和中药材饮片的鉴定领域[14，15]。本研究尝试将DNA条形码分子鉴定法用于桔梗种子的真伪鉴定，以保障桔梗种植的种源可靠性，并进一步尝试扩展DNA条形码分子鉴定法的适用范围。

1 材料方法

1.1 材料

本研究共收集29份样品，包括中药材桔梗基原植物样品10份，中药材桔梗种子样品19份。桔梗基原植物样品经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，存放在中国医学科学院药用植物研究所。种子植物样品采集于桔梗中药材产地，样品存放于国家药用植物种质资源库，样品信息见表1。

表1 实验样品信息表

1.2 方法

1.2.1 种子形态特征观察

选择饱满成熟的桔梗种子，使用LY-WNHPCCD型动态显微成像系统（成都励扬精密机电有限公司）观察桔梗种子外部形态特征（如形状、颜色、表面纹理等）。使用游标卡尺（上海九量五金工具有限公司）测量桔梗种子长、宽、厚。使用Carestream X射线影像工作站系统（加拿大Carestream Health公司）对桔梗种子内部结构进行观察。采用百粒法测定桔梗种子千粒重[16]。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增及序列测定

取1粒种子，使用75%乙醇擦拭表面，待乙醇挥干后置2.0 mL离心管中，用DNA提取研磨仪（RETSCH MM400，德国）研磨2 min（30次/s），使用天根植物DNA提取试剂盒提取总DNA，加入裂解液后，使用DNA提取研磨仪重复研磨1次，65℃水浴2 h，剩余步骤参照《中国药典中药材DNA 条形码标准序列》[8]。用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美国）检测DNA质量。PCR扩增引物、体系及反应条件参照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[9]。

1.2.3 数据分析

测序峰图利用CodonCode Aligner V5.1.5（Codon-Code Co.，美国）进行拼接和校对。依照中药材DNA条形码指导原则进行测序峰图质量评估。基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov model）注释获得ITS2序列[17]。使用MEGA 6.0进行序列比对、变异分析和遗传距离计算[18]。基于中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）和《中国药典中药材DNA 条形码标准序列》进行物种鉴定[8, 9]。

2 结果

2.1 桔梗种子形态特征

桔梗种子以倒卵状椭圆形为主，成熟种子棕色或深褐色，成熟度较差的种子颜色稍浅，桔梗种子群体颜色不均匀。桔梗种子平均长度2.21 cm，平均宽度1.34 cm，平均厚度0.67 cm，千粒平均质量1.19 g，桔梗种子群体大小较不均匀。桔梗种子在自然光下有光泽，一侧珠被表皮细胞外凸形成种翅，常较窄，颜色稍浅或呈淡棕黄色。桔梗种子在40倍体式显微镜下可观察到较密的黑色细纹。X光透视观察桔梗种子胚乳白色半透明，胚极小，呈一亮点，成熟度较差的种子颜色暗淡，胚乳不饱满或观察不到胚，桔梗种子群体成熟度差异较大。

2.2 桔梗种子DNA提取优化、PCR扩增和测序

桔梗种子较小，单粒种子质量仅约1 mg，DNA提取需挑选成熟度较好的饱满种子。桔梗种子胚乳具油性，含有较多的糖类、脂类和蛋白质，消化后需加入与裂解液等体积的氯仿∶异戊醇混合液（体积比24∶1）进行抽提，并加入等体积预冷异丙醇沉淀DNA，沉淀中常见部分白色胶状物质。由于桔梗种子较小，过柱纯化后加入30-50 μL无菌水洗脱获得DNA。NanoDrop 2000检测DNA纯度常较差，260/230常小于1，但不影响后续PCR扩增和测序。所有样品都可成功进行PCR扩增并获得高质量双向测序结果。

2.3 桔梗种子物种DNA鉴定和纯度检测

本研究共获得67条序列，其中基原植物序列10条，种子序列57条，分为4个不同的单倍型，主导单倍型与《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中桔梗主导单倍型序列特征相同。20位点未发现插入/缺失变异。59位点新发现T-C变异，为来自于河南和安徽的2份种子样品。将所获得的桔梗4个单倍型ITS2序列，依次输入中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）的植物类药材鉴定（ITS2）窗口，点击提交进行鉴定。鉴定结果显示，所有4个单倍型均与桔梗科植物桔梗P. grandiflorum的序列最为接近。此外，14份样品内ITS2序列无差异，5份样品内ITS2序列存在差异。

图1 种子群体图、40倍显微图和X光透视图

3 讨论

3.1 市售桔梗种子形态特征差异较大，识别困难

桔梗为桔梗科多年生草本植物，据《中国植物志》英文修订版记载，中国桔梗属仅桔梗1个物种，花色蓝色或紫色，少有粉色和白色。桔梗是一种药、食、赏兼用植物，在中国、前苏联远东地区、朝鲜半岛、日本列岛均有分布，为广布种，种质资源丰富，不同种源甚至同一种源群体内的种子形状、颜色、种翅的宽窄、颜色等性状存在明显差异，单纯依赖形态特征进行鉴定较困难[19]。本研究结果表明，19份桔梗种子样品中，5份样品存在群体内ITS2序列差异。自然条件下桔梗主要依靠异花授粉，自花授粉结实率低，不同种源杂交后收获的F0种子中，存在不同于黑色或棕色的黄绿色、灰绿色桔梗种子或杂色种子及各种过渡类型的种皮颜色[20]。桔梗花期较长，市售桔梗种子的成熟度存在较大差异[21]。X光透视发现多数种子样品存在不同比例种子的颜色暗淡，胚乳不饱满或观察不到胚。不同成熟度的桔梗种子不仅形态特征存在差异，而且影响种子的发芽率。

3.2 种子鉴定尚缺乏统一方法，DNA条形码技术具有明显优势

中药材质量控制需要中药材生产的规范化，中药材生产规范化需要中药材种子生产的标准化[22]。种子是中药材生产的物质基础，优良品种及优质的种子是实现中药材规范化生产的基础。当前中药材种子处于管理真空，尚无专门针对中药材种子质量检验、控制的机构和执法部门，在从法理职能上隶属于农业系统，多数中药材种子缺乏国家质量标准[23]。绝大部分种子主要来自药材生产基地和农户留种，种子经营无专业市场与渠道，种子质量参差不齐，种源混杂，存在掺伪现象[24]。中药材种子以形态鉴定为主，如种子形状、大小、颜色、光泽、表面纹理、表面附属物、内部解剖结构（胚的性状、大小、位置、胚乳）等[25]。某些特征常受种质资源、群体差异、种子成熟度、自然天气等影响，并不稳定[19]。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，鉴定客观，其指导原则已经纳入中国药典[26]。本研究优化种子DNA提取方法，可以获得桔梗单粒种子的DNA条形码序列，然后依照《中国药典中药材DNA 条形码标准序列》和中药材DNA条形码鉴定系统对桔梗种子进行鉴定，为其他中药材种子鉴定提供参考。

表2 基于中药材DNA条形码鉴定系统的桔梗种子单倍型鉴定结果

1 国家药典委员会.中国药典(一部).北京:中国医药科技出版社, 2015∶ 277.

2 徐国钧,徐珞珊.常用中药材品种整理和质量研究,南方协作组(第二册).福建:福建科学技术出版社, 1997∶ 218-238.

3 胡世林.中国道地药材. 哈尔滨:黑龙江科学技术出版社, 1989∶38.

4 何美莲,程小卫,陈家宽,等.桔梗皂苷类成分及其质量分析.中药新药与临床药理, 2006, 16(6)∶ 457-460.

5 宋杨,齐云.桔梗的药理研究进展.中国药房, 2006, 17(2)∶ 140-141.

6 泰阳,侯建平,孟建国,等.桔梗的药理学研究进展.现代中医药, 2009(6)∶ 74-75.

7 金在久.桔梗的化学成分及药理和临床研究进展.时珍国医国药, 2007, 18(2)∶ 506-509.

8 陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列.北京:科学出版社, 2015∶ 367-368.

9 陈士林,姚辉,韩建萍,等.中药材 DNA条形码分子鉴定指导原则.中国中药杂志, 2013, 38(2)∶ 141-148.

10 Xiang L, Song J, Xin T, et al. DNA barcoding the commercial Chinese caterpillar fungus. FEMS Microbiol Lett, 2013, 347(2)∶ 156-162.

11 Yao H, Song J Y, Ma X Y, et al. Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA-trnH intergenic region. Planta Med, 2009, 75(6)∶ 667-669.

12 Chen S, Pang X, Song J, et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnol Adv, 2014, 32(7)∶1237-1244.

13 辛天怡,李西文,姚辉,等.中药材二维 DNA 条形码流通监管体系研究.中国科学:生命科学, 2015, 45(7)∶ 695-702.

14 Xin T, Yao H, Gao H, et al. Super food Lyciumbarbarum (Solanaceae) trace ability via an internal transcribed spacer 2 barcode. Food Res Int, 2013, 54(2)∶ 1699-1704.

15 Xin T, Li X, Yao H, et al. Survey of commercial Rhodiola products revealed species diversity and potential safety issues. Sci Rep, 2015, 5∶8337.

16 肖承鸿,周涛,江维克,等.太子参种子品质检验方法及质量分级标准研究.中国中药杂志, 2014, 39(16)∶ 3042-3047.

17 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28SrRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430(1-2)∶ 50–57.

18 Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol Biol Evol, 2013, 30(12)∶ 2725-2729.

19 孙丽娜,严一字,李美善,等.桔梗种群内种子形态的变异类型研究.延边大学农学学报, 2007, 29(1)∶ 19-23.

20 魏建和,杨世林,李先恩,等.桔梗不同种质的比较研究——桔梗的杂交有花色,种色的新类型与分离.中草药, 2002, 33(5)∶ 455-458.

21 刘自刚,张雁,王新军,等.桔梗种子活力研究进展.种子, 2006, 25(4)∶ 48-51.

22 魏建和,杨成民,隋春,等.中药材新品种选育研究现状,特点及策略探讨.中国现代中药, 2011, 13(9)∶ 3-8.

23 魏建和,陈士林,程惠珍,等.中药材种子种苗标准化工程.世界科学技术-中医药现代化, 2006, 7(6)∶ 104-108.

24 张丽萍,王康正.我国药材种子种苗产业存在的问题及其对策.中国中药杂志, 1999, 24(10)∶ 579-581.

25 郭巧生.中国药用植物种子原色图鉴.北京:中国农业出版社, 2009∶ 364.

26 国家药典委员会.中国药典(2010年版第三增补本).北京:中国医药科技出版社, 2014∶ 217.

Identification of Platycodonis Radix Seeds by Using ITS2 DNA Barcode

Liu Jinxin1, Pan Min2, Zhang Gaixia3, Zhao Chunying1, Shi Linchun1, 3(1. Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Chinese Medicine, Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 2. Jinan Maternity and Child Care Hospital, Jinan 250001, China; 3. Institute of Chinese Materia Medica, Peking Union Medical College, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100193, China )

Platycodonis radix is one of the common used herbs, and is widely applied for both medicines and food. To establish a method for identifying the Platycodonis radix by using DNA barcoding is a very important target. In this study, 29 specimens including leaves and seeds of Platycodonis radix had been collected from nine provinces. The morphological characters were surveyed with stereoscopic microscope and X-ray workstation. DNA was extracted from a single seed via optimizing the DNA extraction method. The species identification for each sample was carried out according to DNA barcode identification system (http://www.tcmabarcode.cn) and standard Platycodonis radix barcodes from the book, The Standard DNA Barcodes of Chinese Material Medica in Chinese Pharmacopoeia. The results showed that the morphological characters and grades of maturity remain presented some differences among specimens from different sources. This experiment can realize the DNA extraction, PCR amplification and sequence determination of a single Platycodonis radix seed (about 1 mg). ITS2 sequences from five seed specimens lacked consistence. The Chinese material medica DNA barcode identification system and The Standard DNA Barcodes of Chinese Material Medica in Chinese Pharmacopoeia can be used as references for the seed identification. It was concluded that the seed of traditional Chinese materials can be identified through DNA barcoding method, which will contribute to the seed and seedling standardization project of medicinal materials.

Platycodonis radix, seed, morphological character, DNA barcoding, identification

10.11842/wst.2016.02.005

R282.5

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-01

＊ 国家自然科学基金委青年科学基金项目（81303158）：全基因组关联分析鉴定深层发酵灵芝菌株三萜高产关联多态性位点，负责人：石林春；科学技术部国家科技支撑计划（2011BAI07B08）：中药材质量评价体系建立及其质量标准示范研究子课题——中药种子种苗 DNA条形码鉴定及流通管理平台的建立，负责人：陈士林。

＊＊ 通讯作者：石林春，副研究员，主要研究方向：中药资源与鉴定研究。