白头翁属药用植物及药材鉴别研究＊

张立秋，于俊林，姚 辉，石林春，宋经元＊＊

（1.通化师范学院 制药与食品科学学院 通化 134002；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

白头翁属药用植物及药材鉴别研究＊

张立秋1，于俊林1，姚 辉2，石林春2，宋经元2＊＊

（1.通化师范学院 制药与食品科学学院 通化 134002；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

目的：本研究对白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁3种药用植物及药材进行了形态分类和ITS2序列分子鉴别研究，为建立其分子鉴定方法提供有力依据。方法：通过对长白山区白头翁属3种药用植物进行野外实地考察采样，形态分类描述及提取样品总DNA，扩增ITS2序列、双向测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接、比对，采用MEGA 6.0软件对样品进行变异位点分析、计算种内和种间遗传距离（K2P）并构建邻接树（NJ）。结果： 形态鉴别容易区分白头翁与朝鲜白头翁和兴安白头翁，但朝鲜白头翁和兴安白头翁不易区分，ITS2序列片段长度均为219 bp，3种药用植物的药材ITS2序列与其基原植物序列一致，种间变异位点有6个，遗传距离显示物种种内最大K2P距离远远小于种间最小K2P距离，NJ 树结果显示，白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁均可明显区分。结论：ITS2 序列能够准确鉴定白头翁属3种药用植物的药材和基原植物，可作为形态鉴别的有力补充。

白头翁属 形态鉴别 分子鉴定 DNA条形码 ITS2

白头翁属（Pulsatilla Adans）为毛茛科（Ranunculaceae）多年生草本植物，有根状茎，常有长柔毛。全世界约有43种，中国有11种，主产北温带[1]，其中东北分布有白头翁P. chinensis（Bunge）Regel、朝鲜白头翁P. cernua（Thunb.）Bercht.et Opiz、兴安白头翁P. dahurica（Fisch.）Spreng。白头翁属植物中大多数含有两种类型五环二萜皂苷化合物，即羽扇豆烷型和齐墩果烷型[2-6]。现代药理研究表明，白头翁属植物具有抗肿瘤[7-9]、抗炎，抗氧化、抗菌，增强免疫等功效[10，11]，近年研究还发现朝鲜白头翁所含的某些活性成分对治疗阿尔茨海默病效果显著[2，4]。《中药大辞典》中记载，该属多种植物被当作《中国药典》收载的同属植物白头翁入药[12]，目前国内白头翁药材主要靠采挖野生植株获得，白头翁药材形态及活性成分相似，难以用形态及理化等方法有效鉴别[13]。另外朝鲜白头翁和兴安白头翁在植株形态上极其相似，不易鉴别区分。

DNA 条形码技术（DNA Barcoding）是利用一段标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA 片段自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统， 它可以对物种进行快速准确鉴定[14]。目前DNA 条形码研究技术已逐步走向成熟[15]，对于分类学中难以区分的类群，采用 DNA 条形码可以抛开形态上的假象，从基因水平上提供一种分类依据[16]。本研究通过对白头翁属物种进行野外形态观察描述，并采用DNA条形码ITS2序列，对来自吉林和辽宁省内的样品进行研究和探讨，为白头翁属药用植物的药材来源及基原物种的确定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本文共收集58份样品，包括白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁3个物种，分别来自辽宁省，吉林省的长春市、通化地区各县。样品经通化师范学院于俊林教授鉴定，保存在中国医学科学院药用植物研究所，详细信息见表1。

1.2 方法

取硅胶干燥叶片约20 mg， 用DNA提取研磨仪研磨2 min（30次/s）后， 用植物 DNA提取试剂盒提取总DNA；药材提取参考罗焜等[17]研究方法，ITS2序列引物、PCR反应条件、序列拼接及比对参照Chen 等[18，19]研究。应用MEGA 6.0进行种内和种间遗传距离计算[20]，用NJ法构建系统聚类树。

表1 试验样品信息表

2 结果与分析

2.1 形态描述

2.1.1 白头翁

多年生草本，高50 cm左右，全株密被白柔毛。根圆锥形。基生叶三出，3全裂，中央裂片通常具柄，3深裂，侧 生裂片较小，不等3裂；叶柄长5-7 cm。花果期4-6月。分布中国大部分地区，生于草地、山坡、林缘、河岸及灌丛。详见图1。

2.1.2 朝鲜白头翁

植株高10-40 cm，全株被开展的白毛。根状茎发达，长达3-8 cm，粗约0.5 cm，基生叶多数，叶柄长5-15 cm。叶片羽状全裂，各裂片又2-3深裂，花果期4-6月。分布于辽宁南部，吉林东部。生于草地、山坡、林缘、河岸及灌丛。详见图1。

2.1.3 兴安白头翁P

多年生草本，植株高25-40 cm。根状茎长16 cm，粗5-7 mm。基生叶7-9；叶片三全裂或近羽状分裂，一回中全裂片有细长柄，又三全裂，二回裂片深裂；花果期4-6月。分布中国吉林东部、黑龙江。生于山坡草地、林缘、灌丛。详见图1。

图1 白头翁、朝鲜白头翁与兴安白头翁植株形态特征

2.2 形态鉴别

通过野外跟踪考察，白头翁与朝鲜白头翁及兴安白头翁植株形态上区别显著：白头翁基生叶三出，朝鲜白头翁和兴安白头翁叶片羽状分裂；朝鲜白头翁和兴安白头翁区别为：朝鲜白头翁叶缘有毛，兴安白头翁叶缘无毛，但不易观察鉴别，兴安白头翁花期较朝鲜白头翁花期晚，花期过后，也不易鉴别。药材形态十分相似，不易区分。

2.3 分子鉴定

2.3.1 样品DNA提取、PCR扩增及测序结果

从全部样品的叶和根提取基因组总DNA，对DNA进行PCR扩增，扩增后PCR产物电泳均显示较亮条带，表明基因组总DNA提取质量较好。对PCR产物进行双向测序，得到高质量的ITS2条形码序列。

2.3.2 3种药用植物的ITS2序列特征及其变异位点分析

白头翁属植物白头翁、兴安白头翁和朝鲜白头翁ITS2片段长度均为219 bp，所有基原植物样品叶片获得的ITS2条形码序列的单倍型与从该植物药材根获得的单倍型一致，没有发现新的单倍型。结果表明白头翁、兴安白头翁和朝鲜白头翁间ITS2序列含6个变异位点，38位点处朝鲜白头翁和白头翁都为G，兴安白头翁为A；201位点处朝鲜白头翁和兴安白头翁都为T，白头翁为A，因此在38位点和201位点为G和T的为朝鲜白头翁，G和A的则为白头翁，A和T的则为兴安白头翁。由此利用这两个位点可以将白头翁、朝鲜白头翁与兴安白头翁药材及基原植物很好区分开，结果见表2。

2.3.3 物种ITS2序列的K2P遗传距离分析及NJ树构建

白头翁属3个物种种内和种间遗传距离见表3，结果表明白头翁种内的遗传距离是0-0.004 6，与朝鲜白头翁、兴安白头翁种间遗传距离均为0.013 9-0.018 6，种间最小K2P距离大于种内最大K2P距离。朝鲜白头翁、兴安白头翁的种内遗传距离均为0，种间遗传距离明显大于种内。

基于ITS2序列，采用了NJ法构建了系统发育树（图2），结果表明兴安白头翁、朝鲜白头翁、白头翁各自聚为一支，呈现明显的单系性。所以采用K2P遗传距离、NJ法构建系统发育树均可区分白头翁属3个物种的药材及基原植物。

表2 白头翁、朝鲜白头翁与兴安白头翁ITS2序列变异位点分析

表3 白头翁、朝鲜白头翁与兴安白头翁ITS2序列的K2P遗传距离

4 讨论

通过野外考察，对白头翁属3种药用植物进行形态描述，其中白头翁与朝鲜白头翁和兴安白头翁较易区分，朝鲜白头翁和兴安白头翁不易鉴别。王胜勇等[21]对白头翁同名异物类药材进行了显微鉴定，结果表明白头翁属植物的韧皮纤维、木质部、髓部和中心部裂隙的显微特征可用于鉴别白头翁属植物。李海燕等[22]对白头翁属药用植物的HPLC指纹特征研究表明，可以区分白头翁和朝鲜白头翁，但无法区分细叶白头翁和兴安白头翁。本属的这3个种在形态指标中除叶裂片数、裂片形态等少数指标有分类意义外，大部分指标差异区分不显著，因此寻找稳定的分类指标及考察影响指标变异的因素是深入研究的方向。

辛天怡等研究表明ITS/ITS2对羌活药材及基原植物均可进行鉴别[23]。张午曲等[24]报道对4种白头翁属药用植物的ITS序列进行研究，将白头翁和兴安白头翁归为一组，朝鲜白头翁和细叶白头翁归为一组，该研究只收集4个样本进行DNA提取分析，试验的样本数少，不能反映种内的变异情况。本研究通过分析比较白头翁属3个种ITS2序列的变异位点、种内和种间K2P距离及NJ树，结果表明ITS2序列可以准确鉴别白头翁和兴安白头翁及朝鲜白头翁的药材及基原植物。与其它的传统方法相比，DNA条形码技术具有材料用量少、鉴定准确的优点；对形态上鉴定较难的朝鲜白头翁和兴安白头翁，有着很大优势。

《中国药典》收载的正品药材来源为白头翁，朝鲜白头翁和兴安白头翁作为地方习用药材也被使用入药，而明确药材品种来源对保证用药安全具有重要意义，但非专业的药材鉴别人员很难准确区分各品种的药材，而DNA条形码鉴定不受药材性状的影响，即使没有任何鉴别经验的人员通过DNA条形码标准化操作流程可快速、准确完成对白头翁属3种药用植物及其药材的鉴别。后续还应进一步加大白头翁属基原植物和药材的样本量，为开展白头翁属药用植物的形态和分子鉴定分类系统研究奠定基础。

图2 基于ITS2序列构建白头翁、朝鲜白头翁与兴安白头翁的NJ树

1 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.北京:科学出版社, 1980∶ 62．

2 王长福,孙世芹,王有志,等.朝鲜白头翁抗炎有效部位化学成分研究.中草药, 2013, 44(18)∶ 2508-2514．

3 Bang S C, Kim Y, Lee J H, et al. Triterpenoid saponins from the roots of Pulsatilla koreana. J Nat Prod, 2005, 68(2)∶ 268．

4 Xu T H, Xu Y J, Han D, et al. Triterpenoid Saponins from Pulsatilla cemua (Thunb.) Bercht.et Opiz. J Integr Plant Biol, 2006, 49(2)∶ 202.

5 张庆文,叶文才,赵守,等.朝鲜白头翁的三萜皂苷研究.药学学报, 2000, 35(10)∶ 756.

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7 Son M K, Jung K H, Hong S W, et al. SB365, Pulsatilla saponin D suppresses the proliferation ofhuman coloncancer cells and induces apoptosis by modulating the AKT/mTOR signaling pathway. Food Chem, 2013, 136(1)∶ 26.

8 Hong S W, Jung K H, Lee H S, et al. SB365 inhibit sangiogenesis and induces apoptosis of hepatocellularcarcinoma through modulation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Cancer Sci, 2012, 103(11)∶ 1927.

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11 钟长斌,李祥.白头翁的化学成分及药理作用研究述要.中医药学刊, 2003, 21(8)∶ 1338-1339,1365.

12 江苏新医学院.中药大辞典(上册).上海:上海科学技术出版社, 1997∶ 704．

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22 李海燕,李宏博,朴钟云,等.白头翁属药用植物的HPLC植物特征与化学分类研究.中国中药杂志, 2011, 36(11)∶ 1478．

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24 张午曲,李海燕,李宏博,等.白头翁属药用植物的ITS序列分子鉴定研究.时珍国医国药, 2015, 26(4)∶ 900-902．

Identification of Plants and Medicinal Materials in Pulsatilla Mill.

Zhang Liqiu1, Yu Junlin1, Yao Hui2, Shi Linchun2, Song Jingyuan2
(1. College of Pharmaceutical and Food Science, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

This study was designed to identify Pulsatilla chinensis, P. cernua and P. dahurica, and carry out their morphological classification and molecular identification. After field investigation and sampling the three medicinal plant species in Changbai Mountain area, morphological characters of the three species were described. The ITS2 sequences were amplified and sequenced bi-directionally. Then the sequences were assembled and compared by CodonCode Aligner. The genetic distances were computed in accordance with the kimura 2-parameter (K2P), while the NJ tree was built by using MEGA 6.0. Based on morphological characters, P. chinensis can be easily distinguished from P. cernua and P. dahurica, while P. cernua was difficult distinguished from P. dahurica. It was also found that the ITS2 sequences of three medicinal plant species had 219 bp in length, while the medicinal materials and the original plants shared the same ITS2 sequence. There were 6 variations of ITS2 sequences in the three medicinal plant species. The maximum intra-specific genetic distances were lower than the minimum inter-specific genetic distances. The NJ tree exhibited that the three species could be distinguished. All the results demonstrated that the ITS2 sequences could identify the three original plants and medicinal materials of Pulsatilla Mill. accurately, which brought out a useful tool for species identification.

Pulsatilla Mill., morphological identification, molecular identification, DNA barcoding, ITS2

10.11842/wst.2016.02.004< class="emphasis_bold">中图分类号：R

R282.5

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：朱黎婷 王 晶）

2015-11-30

修回日期：2015-12-01

＊ 科学技术部国家科技基础性工作专项项目子项目（2014FY130400）:长白山区药用植物资源考察与DNA条形码数据采集，负责人：于俊林。

＊＊ 通讯作者：宋经元，本刊编委，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药资源学、DNA条形码。