两种PMS肝气逆证大鼠模型造模方法的效果比对分析＊

孙 鹏，李 倩，朱德豪，魏 盛

（山东中医药大学 脑行为分析实验室 济南 250355）

两种PMS肝气逆证大鼠模型造模方法的效果比对分析＊

孙 鹏，李 倩，朱德豪，魏 盛＊＊

（山东中医药大学 脑行为分析实验室 济南 250355）

目的：本文主要研究PMS肝气逆证标准化大鼠模型的造模方法。方法：分别采用情志刺激为主择时分段刺激造模法和情志刺激为主连续刺激造模法，制备PMS肝气逆证大鼠模型，选择氟西汀分散片和白香丹胶囊进行药物干预。通过对2种造模方法所得关键行为学指标结果进行比对分析，筛选出最佳造模条件。结果：①择时分段刺激造模法可以诱导大鼠的焦虑样行为，并且在非接受期减弱、接受期加强，大鼠的各行为学指标间发生明显的同步改变，给予临床PMS肝气逆证有效药物能够改善这一现象；与正常组相比，造模组的各项行为学指标具有统计学差异。②连续刺激造模法也可诱导大鼠的焦虑样行为，但给予药物干预后没有改 善；在各项焦虑样行为指标中，仅进入开放臂时间百分比在接受期和非接受期存在明显变化；虽然与接受期相比，模型组大鼠非接受期进入开放臂次数和百分比下降、旷场实验总分提高，但其结果没有统计学差异。结论：情志刺激为主的择时分段刺激造模法，诱导出的PMS肝气逆证大鼠模型，更为契合PMS肝气逆证患者临床表现。

PMS 肝气逆证 动物模型 造模方法

经前期综合征（Premenstrual Syndrome，PMS）是一组周期性出现在月经周期黄体期的身体、精神和行为3方面的症候群，并影响妇女的日常生活和工作，其中，肝气逆证是PMS的主证之一[1,2]。近年来，PMS发病率逐渐增高，日益受到国内外医学界的关注。课题组前期研制的情志刺激为主多因素连续造模法[3,4]制备的PMS肝气逆证大鼠模型，已被界内普遍认可和广泛采用。但是该方法，在大鼠的非接受期（即人的月经周期黄体期）仍进行造模应激刺激，显然在病理病机上与临床病患不符[5]。因此，本实验选择情志刺激为主多因素择时分段刺激造模法制备PMS肝气逆证大鼠模型，并比对分析课题组前期的连续刺激造模法，以实现PMS肝气逆证大鼠模型造模方法的标准化，为PMS的研究提供更为准确的病症结合动物模型。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雌性Wistar大鼠，健康未孕，体质量160-180 g。北京维通利华实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2007-0001。

1.2 主要药品

无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，批号：XK1301100015）；生理盐水（辰欣药业股份有限公司，批号：1404132143）；氟西汀分散片（礼来苏州制药有限公司，批号：H20050463）；白香丹胶囊（青岛海川创新生物天然药物研究中心，批号：20071020）。

1.3 主要仪器

旷场实验箱（山东中医药大学脑行为分析实验室自制）；高架十字迷宫（山东中医药大学脑行为分析实验室自制）；ST-A数字脉冲生物刺激仪（济南空军后勤装配总厂、山东中医药大学联合研制）。

2 实验方法

2.1 筛选动物

实验开始之前，适应性饲养大鼠7天，条件：昼夜颠倒环境（20∶00开灯，08∶00关灯）、恒温（23±3℃）、恒湿（60±5%RH）。选择简易阴道涂片镜检法[6]：连续8天阴道涂片、1次/天，筛选出40只动情周期规律 的大鼠进入实验。然后适应性饲养8天（饲养条件同上），并参照Rygula R.等[7]研究，每日抓握全部大鼠，时间控制在5 min以上。暗淡灯光（＜28 lx）下进行所有实验操作[8]。

2.2 动物分组

适应性饲养后，即实验第9日，对动情周期规律的40只大鼠，进行糖水偏好实验（Sucrose Preference Test，SPT）、旷场行为学（Open Field Test，OFT）、高架十字迷宫实验（Elevated Plusmaze Test，EPM），采集相关数据，并随机分为以下4组：正常对照组（Control）、PMS肝气逆证模型组（Model）、氟西汀干预组（FXT）、白香丹干预组（BXD）。

2.3 动物模型制 备

2.3.1 连续刺激造模法（实验Ⅰ）

根据本课题组前期研究结果[3]，对第一批次拟造模大鼠，从实验第13日起，行连续5天的情志刺激为主多因素造模法。具体操作：将模型组、氟西汀组和白香丹组大鼠，置于ST-A数字脉冲生物刺激仪内，调整刺激条件：中等强度电流0.5 mA、电压2 700-3 300 V、脉宽0.3 s、白天2档（间隔时间5 min）、夜间3档（间隔时间10 min）。

2.3.2 择时分段刺激造模法（实验Ⅱ）

结合连续刺激造模法，仅在两个动情周期的非接受期刺激大鼠，改进操作如下：对第二批次拟造模大鼠，从实验第13日起，行连续2天的造模刺激，接着暂停一日，然后继续行连续2天的造模刺激。余造模条件同上。

2.4 给药剂量和方法

各组大鼠于每日09∶00，按1 mL/100 g同时灌胃给药，1次/日。正常组与模型组，给予等量纯水。造模刺激同时，氟西汀组大鼠采用2.7 mg·kg-1·d-1氟西汀分散片灌胃干预；白香丹组大鼠给予200 mg·kg-1·d-1白香丹胶囊灌胃治疗[9]。实验Ⅱ中，在造模第15日（即非造模刺激时），予氟西汀组和白香丹组大鼠以等量纯水灌胃。

2.5 行为学数据的采集与测定

分别于实验第9日、第10日（即造模开始前2天）07∶00采集大鼠相关行为学数据，作为接受期基线（R1）、非接受期基线（NR1）；于实验第18日、第19日（即造模结束后两天）07∶00采集大鼠相关行为学数据，作为造模后的接受期数据（R2）、非接受期数据（NR2）[10]。具体如下：

2.5.1 糖水偏好实验（大鼠兴趣偏好缺失度考察）

参照 Pandey D.K.等研究[11]，本实验的糖水偏好实验，予以大鼠1 h内纯水、0.8%蔗糖水溶液自由选择，并半小时置换瓶子位置一次，以避免大鼠偏饮一侧水。糖水偏好系数（Sucrose Consumption，SC）：SC%=糖水消耗/（糖水消耗+纯水消耗）× 100%[10]。

2.5.2 旷场实验（大鼠运动与探究行为[12]）

将大鼠置于旷场实验箱最中央的方格中，3位观测者同时记录大鼠3 min内的直立次数和穿越底面方格次数，前者记为垂直得分（以大鼠两前爪腾空或攀附墙壁为准），后者记为水平得分（以大鼠四爪均进入方格为准），旷场实验总得分=垂直得分+水平得分[13]。得出各组得分情况后，盲法进行行为学评定。

2.5.3 高架十字迷宫实验（大鼠焦虑程度考察[14]）

将大鼠置于高架十字迷宫中央平台，3位观测者同时记录5 min内大鼠的如下行为学指标[15]：①进入开放臂次数（Open Arm Entry，OE）：大鼠肩部以上进入开放臂的次数；②进入封闭臂次数（Close Arm Entry，CE）：大鼠肩部以上进人封闭臂的次数；③进入开放臂时间（Open Arm Time，OT）：大鼠肩部以上进入开放臂的时间；④进入封闭臂时间（Close Arm Time，CT）：大鼠肩部以上进入封闭臂的时间，并由以上指标分别计算出：⑤大鼠进入开放臂和封闭臂的总次数（Locomotor Activity in EPM，LA in EPM=OE+CE）；⑥进入开放臂次数百分比[OE%=OE/（OE+CE）×100%]；⑦开放臂停留时间百分比[OT%=OT/（OT+CT）×100%][16]。采用盲法进行行为评定。

2.6 行为学指标的筛选

结合课题组前期经验，选择OFT、SPT、EPM实验中稳定性较高、复测信度良好的行为学指标纳入统计,具体指标：糖水偏好系数（SC%）、旷场实验总分（LA）、进入开放臂次数百分比(OE%)、开放臂停留时间百分比（OT%）[17,18]。

2.7 数据统计与处理

选用GraphPad Prism 6.0统计软件，采用单因素方差分析法,对造模后接受期与非接受期的行为学指标进行统计，组间比较用Bonferroni校正t检验，显著差异水平设定为P＜0.05。

3 结果

3.1 连续刺激造模后大鼠接受期及非接受期关键行为学指标结果

如图1所示，连续刺激造模后：①接受期：与模型组相比，氟西汀组大鼠SC%明显升高（P＜0.05）；与正常组相比，模型组、氟西汀组大鼠LA明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，白香丹组大鼠OT%明显下降（P＜0.05）；②非接受期：与模型组相比，白香丹组大鼠SC%明显上升（P＜0.05）；与正常组相比，模型组、氟西汀组大鼠LA明显升高（P＜0.01，P＜0.01）；与模型组相比，白香丹组大鼠LA明显下降（P＜0.05）。余参数接受期与非接受期均未见显著性差异（P＞0.05）。

3.2 择时分段刺激造模后大鼠接受期与非接受期关键行为学指标结果

如图2所示，择时分段造模刺激后：①接受期：各组大鼠间，均不存在明显差异；②非接受期：与正常组相比，模型组大鼠SC%、OT%、OE%明显下降（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）、LA明显上升（P＜0.001）；与模型组相比，氟西汀组大鼠SC%、OT%、OE%明显上升（P＜0.001，P＜0.05，P＜0.01）、LA明显下降（P＜0.001）；与模型组相比，白香丹组大鼠SC%、OT%、OE%明显上升（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），LA则明显下降（P＜0.01），但仍显著高于正常组（P＜0.05）。

图2 择时分段刺激造模后大鼠接受期与非接受期关键行为学指标比较

4 讨论

王俊仁[19]研究发现：在不同的动情周期刺激大鼠，会产生不同效果。课题组前期在PMS肝气逆/郁两证猕猴模型制备的探索中，也发现于雌性猕猴的黄体中晚期（相当于人经前期）进行挤压造模刺激，可诱导猕猴出现与PMS临床患者典型症状相类似的行为表现[20]。综上分析，我们初步推论：仅在大鼠连续2个动情周期的非接受期进行造模刺激，大鼠可能出现PMS样情绪改变。

前期临床流行病学调查中，课题组已提出PMS肝气逆证的初步诊断标准为：主证：急躁易怒、头目眩晕、头胀痛，两胁窜痛、胃脘胀痛；次证：失眠多梦、吞酸嗳气、肠鸣腹泻、月经先期、脉弦、表情亢奋。主证“急躁易怒”为必备证状，兼有其他任何一项及以上次证者诊断为肝气逆证[21]。针对临床PMS肝气逆证患者上述症状表现，本课题组采用SPT-OFT-EPM多种行为学方法，对动物模型进行评价。糖水偏好实验结果显示：①择时分段刺激造模法在非接受期，模型组大鼠SC%水平明显下降，予以药物干预后，SC%水平有所上升，与临床PMS患者抑郁样表现类似；②采用连续刺激造模法虽出现上述变化，但不存在显著的统计学差异。由此可见，择时分段刺激造模法，能够诱导PMS肝气逆证大鼠快感缺失样行为表现，动物实验中这一表现往往是和焦虑样行为伴随产生的。旷场实验结果发现，择时分段刺激造模法显示，模型组大鼠在关键行为学指标LA上增加极为明显；连续刺激造模法显示模型组大鼠在该指标上明显增加。这提示择时分段刺激造模法，对大鼠整体兴奋性、敏感性的影响较连续刺激造模法更为明显，行为表征上更为契合PMS临床病患焦虑亢奋特征。高架十字迷宫结果发现，择时分段刺激造模法显示模型组大鼠OT%、OE%明显降低，予以白香丹或氟西汀干预后，OT%、OE%均明显升高；连续刺激造模法显示，模型组和正常组大鼠OT%、OE%均低，且不存在显著性差异。相比较而言，择时分段刺激造模法各组大鼠在OT%、OE%等指标上存在更为显著的差异，证实该方法可成功诱导大鼠焦虑样行为，这一行为的意义与临床患者出现的急躁易怒情绪行为是等同的。

综合上述实验结果，再次证实我们上面的推论：仅在大鼠连续两个动情周期的非接受期进行造模刺激，制备的PMS肝气逆证大鼠模型，大鼠的行为学表现，更类似于临床患者中出现的性情急躁易怒、紧张亢奋、焦虑等症状。

同时，我们还发现，择时分段刺激造模法可以诱导大鼠焦虑样行为的出现，并且在非接受期减弱、接受期增强，大鼠各行为学指标间发生同步改变，临床PMS肝气逆证有效药物能够改善这一现象；相比于正常组，模型组的各项行为学指标具有明显差异。连续刺激造模法同样可以诱导上述现象的出现，但不能被药物所纠正；焦虑样行为指标中，仅OT%在接受期和非接受期存在明显变化；虽然与接受期相比，模型组大鼠非接受期OE%下降、LA上升，但其结果不存在显著的统计学差异。

综上所述，择时分段刺激造模法制备的PMS肝气逆证大鼠模型，其类临床症状的一组行为学指标统计学差异明显；而连续刺激造模法制备的模型，只有一部分行为指标有轻微变化，无统计学意义。因此，制备PMS肝气逆证大鼠模型，较之择时分段刺激造模法，情志刺激为主择时分段刺激造模法所诱导的模型，与PMS肝气逆证患者临床表现更为契合。

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Comparing and Analyzing Effects of Two Modeling Methods on PMS Liver-Qi Invasion Rat Model

Sun Peng, Li Qian, Zhu Dehao, Wei Sheng
(Laboratory of Behavioral Brain Analysis, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

This study was designed to compare effects of two modeling methods in order to explore a standardized modeling method for premenstrual syndrome (PMS) liver-qi invasion syndrome. Based on the model replication methods, timing stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method and continuous stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method were selected to establish PMS liver-qi invasion rat models. Model rats were treated with Baixiangdan capsules and fluoxetine tablets. As a result, firstly, an optimal modeling method would be chosen by means of comparing and analyzing main behavioral indexes of the two modeling methods. It was found that anxiety-like behavior of rats was occurred through timing stimulation modeling method, which was enhanced in the non-acceptance period and was attenuated in the acceptance period in accordance with various behavioral indexes changes. These phenomena were corrected effectively by drug administration of clinical PMS liver-qi invasion syndrome. Compared with the normal group, behavior indexes of model group presented significant differences. Secondly, continuous stimulation modeling method also led to anxiety-like behavior in rats. However, the anxiety-like behavior indexes did not recovered after drug administration of clinical PMS liver-qi invasion syndrome. Among all behavior indexes, only percentage of open arm time changed significantly both in acceptance and non-acceptance period. Compared with acceptance period, though model rats showed lower open arm entry frequency and percentage scores in the non-acceptance period, and a higher score of locomotor activity in open field test, there did not show significant differences of behavior indexes between the two periods. It was concluded that timing stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method induced PMS liver-qi invasion rat model successfully, which was in close relation to clinical syndrome.

Premenstrual syndrome, liver-qi invasion, animal model, modeling method

10.11842/wst.2016.02.002

R749

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：朱黎婷 王 晶）

2015-09-28

修回日期：2015-12-28

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81573854）：经前烦躁障碍（PMDD）肝气逆/郁病证大鼠模型鉴定与标准化，负责人：乔明琦；国家自然科学基金委青年基金（81202617）：母鼠孕前肝疏泄失常对雄性子代行为及神经生化的影响，负责人：魏盛。

＊＊ 通讯作者：魏盛，博士，讲师，主要研究方向：情志病证动物模型构建平台技术及情志致病机理。