不同抑郁症模型下证候差异的品系依赖性研究＊

周 欣，薛文达，李守雪，张海楼，夏宝妹，曲 淼，陈 刚＊＊，唐启盛＊＊

（1. 南京中医药大学 转化系统生物学与神经科学研究中心 中医脑病研究重点实验室 南京 210023；2. 北京中医药大学第三附属医院 北京 100029）

不同抑郁症模型下证候差异的品系依赖性研究＊

周 欣1，薛文达1，李守雪1，张海楼1，夏宝妹1，曲 淼2，陈 刚1＊＊，唐启盛2＊＊

（1. 南京中医药大学 转化系统生物学与神经科学研究中心 中医脑病研究重点实验室 南京 210023；2. 北京中医药大学第三附属医院 北京 100029）

目的：疾病与证候关系的本质是中医学研究的基本问题之一。本研究基于遗传（先天禀赋）参与决定疾病证候的原理，研究小鼠品系差异对抑郁症证候的影响。方法：使用皮质酮皮下重复注射及慢性温和不可预知应激两种方式，在Balb/c和129/S1两种近交系小鼠上进行抑郁症疾病造模。对模型动物进行糖水偏好实验、悬尾实验、强迫游泳实验、新奇环境摄食抑制实验、旷场实验等行为学检测，以及对小鼠证候表型特征：皮毛状态、掌纹血色度、抓力和负重游泳实验进行检测。结果：雄性Balb/c小鼠在两种模型中分别表现出阈下抑郁样行为和抑郁样行为，但是在抓力及掌纹血色表型上都显示气虚样证候。雄性129/S1小鼠在两种模型下都表现出抑郁样行为，从行为绝望分析表现为气郁样证候。两个品系在两种模型下皮毛评分都增加，提示此表型与气虚与气郁都有关系。结论：本研究显示抑郁症证候呈现品系依赖性，且一定程度上独立于造模方法。这为我们进一步利用如 全基因组关联分析等现代技术研究病证相关性的现代生物学本质奠定了基础。

病证结合 抑郁症 品系 皮质酮 慢性温和不可预知应激模型

病证结合是现代中医临床的基本原则，而疾病与证候存在着复杂的关系，同样的疾病在不同的患病人群中可以表现为不同的证候类型，而不同的疾病在同一类人群中也可以表现为相同的证候特点。究其原因，主要是由于个体的先天禀赋以及后天生活环境共同作用带来的。先天禀赋体质因素很大程度上由其遗传物质所决定的，已有多项临床研究支持 遗传变异性作为证候差异的重要来源[1，2]。小鼠作为模型动物，其遗传品系繁多且易于环境控制，可以被用来评价与研究疾病证候差异的遗传基础。

抑郁症是影响公众健康的严重精神疾患，由于抑郁症的高度异质性，再加上病理机制不明，现有的西医治疗有一定的局限性。中医辨证论治抑郁症具有独特的优势，关于抑郁症证候类型差异也已广泛研究[3，4]。为了开展抑郁症中医药治疗机理研究，研究者在临床与基础工作中越来越多地采用病证结合方式。临床研究中如基于人群流行病学的抑郁症证候要素研究[5]，动物模型上，通过抑郁症疾病模型叠加中医证候模型的方法比较常见[6，7]。但是此类模型存在两种造模方法叠加后不确定的关系[8]。而先进行抑郁症疾病造模，再检测疾病与证候的病证结合方法能够更好地模拟疾病的证候特征，具有良好的重复性，也再现了“有是病即有是证”和证候作为疾病本身组成部分的临床实际[9]。

基于遗传因素是决定证候的重要来源，不同遗传背景的动物在疾病证候上可能表现出稳定的差异。为了检验此假设，我们应用两种效度广泛认可的抑郁症造模方法，包括外源性环境应激与皮质酮病理模型，比较了Balb/c与129/S1这两个在精神行为研究上常用的近交系小鼠在抑郁症造模后的病证差异，评价不同的造模方式下遗传品系对抑郁症证候的影响。此研究将有助于理解疾病证候差异性的生物学基础，为进一步解析病证的遗传载体，阐明中医辨证论治精准治疗疾病的科学内涵奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康雄性Balb/c和雄性129/S1小鼠，体质量20-24 g，分别由上海斯莱克实验动物有限公司[实验动物合格证：SCXK（沪）2015-0002]和 南京中医药大学转化系统生物学与神经科学研究中心提供。动物饲养于南京中医药大学转化系统生物学与神经科学研究中心SPF级动物屏障房内，群笼饲养，12 h光照明暗循环（早7∶00开灯，晚7∶00关灯），自由进食与饮水。

1.2 药品与仪器

皮质酮（corticosterone）购自美国sigma公司（批号:95H0092），二甲基亚砜（DMSO）分析纯（CAS 67-68-5），购自南京化学试剂公司。动物行为分析系统：自发活动（旷场实验），悬尾/强迫游泳行为分析系统（DigBehv系列上海吉量软件科技有限公司）；HP-100数显推/拉力计（浙江乐清艾德堡仪器有限公司）。

1.3 造模方式

1.3.1 重复皮下注射皮质酮模型

此种造模方式可以有效诱发模型动物HPA轴功能异常而导致抑郁样行为，控制小鼠个体及品系对于同一应激源产生差异性反应而导致造模结果的差异[10]。每种品系按照体重随机分为对照组和皮质酮组两组，每组8只。皮质酮先溶于DMSO中，然后加生理盐水配成corticosterone 2mg·mL-1+2% DMSO混悬液，振荡乳化均匀。皮质酮组按20 mg·kg-1注射上述乳化药液，对照组注射等体积生理盐水。各组每日下午5点皮下注射，连续给药3周。

1.3.2 慢性温和不可预知应激模型（Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS）

此种造模方式主要以模拟人类罹患抑郁症的环境-心理应激刺激来诱导模型动物的抑郁样行为，与药物干预方式相比更接近于临床。参照之前的方法并有所改良[11]，各品系小鼠随机分为对照组与模型组，模型组每日随机给予一种刺激[24 h禁水、24 h禁食、空笼、斜笼、束缚6 h（将小鼠束缚于自制束缚筒中6 h，小鼠在其中活动受限）、湿笼（将小鼠置于垫料潮湿的鼠笼）]+每周两次彻夜光照（100 W光照持续24 h），连续造模3周。

1.4 抑郁样行为及证候表型测试

造模结束后第2天开始，参考文献进行抑郁焦虑行为测试包括糖水偏好测试、旷场实验、新奇环境摄食抑制测试、悬尾实验与强迫游泳实验[12]，以及各种证候表型测试，包括：前爪掌纹血色比值测试、负重游泳测试、抓力测试和皮毛评分。

1.4.1 糖水偏好测试（Sucrose Preference Test，SPT）

造模前3天，小鼠孤笼喂养，给予2%蔗糖溶液双瓶适应3天，期间自由摄食。然后禁食禁水18 h，给予一瓶2%蔗糖溶液与一瓶普通饮水，检测2 h内蔗糖溶液消耗值与所有液体总消耗的比值，作为评估“失乐”样抑郁状态的重要指标。

1.4.2 旷场实验（Open Field Test，OFT）

测试当天将小鼠放到实验室，先让其适应环境30 min。然后将实验动物从黑色观察箱的底部中央以头部朝前的位置放入，关上箱门，在安静环境下用DigBehv动物行为分析系统连续采集5 min。采用DigBehv动物行分析系统采集、存储和分析视频信号。将每个场划分为中央区域和周边区域。以活动总路程、评价小鼠自发活动的特点，中央区域停留时间评价焦虑样行为。

1.4.3 新奇环境摄食抑制测试（Novelty Suppressed Feeding Test，NSF）

实验前一天所有实验动物禁食16 h，然后将其放入实验室适应30 min。实验开始将小鼠放入微光环境通用隔音试验箱中，箱内中央事先放入称量好的饲料，关上箱门，在安静环境下使用动物行为采集监控系统观察并记录10 min。最后以实验动物进入箱内开始至首次接触并摄入饲料的时间和总的饲料消耗量作为评价实验动物陌生环境下焦虑行为的指标。

1.4.4 悬尾实验（Tail Suspension Test，TST）与强迫游泳实验（Forced Swim Test，FST）

悬尾实验操作如下：实验动物的尾部1-3 cm处以医用微孔胶布黏贴在动物行为分析系统配备的挂钩上，令小鼠头下尾上距离箱底30 cm高处倒悬放入行为分析箱内，持续悬挂6 min，观察记录后4 min小鼠悬挂后停止挣扎的时间（不动时间）。

强迫游泳实验操作如下：采用容量为5 L的透明玻璃烧杯，装入约3 L水，令烧杯内水深约15 cm，水温保持在 25±1℃。将实验动物放入水中，持续游泳6 min，观察记录后4 min小鼠的漂浮时间（在水中停止挣扎和攀爬逃避活动，处于躯体漂浮水面状态的时间）。

1.4.5 前爪掌纹血色比值测试

使用卢氏方法[13]，在室温25℃100 Lux照度下以体视显微镜放大20倍采集模型小鼠前爪脉络图片，利用Photoshop CS软件分析前爪第二三掌趾肉垫间脉络RGB值， 以R值除以RGB值作为评价指标。

1.4.6 负重游泳测试

参照文献[14]，各品系小鼠按体质量8%施以负重，负重物以实验用动脉血管夹捆绑，夹在小鼠尾部1-3 cm处。将小鼠放入5 L容量的玻璃烧杯中，烧杯内装有约3 L的水，水深约15 cm，水温保持在25±1℃。观察并记录从小鼠被放入水中到力竭沉入水底超过8 s的时间。

1.4.7 抓力测试

参照文献[15]，以手持式HP-100数显推/拉力计测量各品系实验动物的抓力，设定仪器自动记录每次每只小鼠的最高抓力，重复测量5次，以其平均最高抓力作为最终记录值。

1.4.8 皮毛评分

参照文献[16]，将小鼠全身分为头颈/前肢部、躯干/背腹部以及下肢/尻尾部3个部分，每个部分皮毛穗结、污秽、枯萎脱落各记1分，总分0-9分。每周评记一次。

1.5 统计学方法

数据处理使用SPSS 17.0软件，结果用均数±标准差（）表示。不同品系对照组与模型组组间，采用two-way ANOVA，分别以品系和造模作为作用因子，多组间两两比较采用tukey's t 检验及SNK-t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮质酮模型

皮下注射皮质酮3周后，OFT的总路程和中央时间上，两个品系的小鼠均无显著变化。在NSF上，Balb/c小鼠无论是潜伏时间还是摄食量上都未见显著变化，而129/S1小鼠则呈现出潜伏时间显著延长（P＜0.05）和摄食量显著下降（P＜0.05）。SPT 上Balb/c小鼠无显著变化，而129/S1小鼠显著下降（P＜0.05）。在行为绝望上，Balb/c同样没有显著变化，而129/S1在TST和FST上都呈现不动时间的显著延长（P＜0.05，P＜0.05）。在证候表型上两个品系的小鼠造模后皮毛评分均显著增加（P＜0.01，P＜0.01）。Balb/c小鼠的抓力与掌纹血色比值均显著下降（P＜0.05，P＜0.05），而129/S1的负重游泳时间呈现显著增加表现（P＜0.05）。详见表1。

表1 Balb/c和129/S1两品系皮质酮皮下注射造模3周后抑郁样行为及证候表型（，n=8）

表1 Balb/c和129/S1两品系皮质酮皮下注射造模3周后抑郁样行为及证候表型（，n=8）

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；采用two-way ANOVA，tukey's t检验。

2.2 CUMS模型

在OFT实验中，Balb/c和129/S1两个品系小鼠中模型组与对照组相比均表现为总路程的显著增加（P＜0.05，P＜0.05），而中央时间显著无变化。在NSF上两个品系均呈现潜伏时间的显著增加（P＜0.05，P＜0.05）和摄食量的显著下降表现（P＜0.05，P＜0.05）。在行为绝望上两个品系小鼠的TST不动时间均显著延长（P＜0.05，P＜0.05），但在FST漂浮时间上只有Balb/c呈现显著增加（P＜0.05），而129/S1却无显著变化。SPT上两个品系也均表现为显著下降的行为（P＜0.05，P＜0.05）。在证候表型上，两个品系小鼠中模型组与对照组相比，皮毛评分均明显增加（P＜0.01，P＜0.01）。抓力与掌纹血色比值上仅Balb/c小鼠呈显著下降（P＜0.05），129/S1无显著变化。在负重游泳时间上，Balb/c小鼠呈现显著增加（P＜0.05），而129/S1小鼠却表现为显著下降（P＜0.05）。详见表2。

表2 Balb/c和129/S1两品系CUMS造模3周后抑郁样行为及证候表型（，n=8-10）

表2 Balb/c和129/S1两品系CUMS造模3周后抑郁样行为及证候表型（，n=8-10）

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；采用two-way ANOVA，SNK-t检验。

3 讨论

本研究使用了遗传差异的两种近交系小鼠，分别以注射外源性皮质酮模拟HPA轴激活的病理因素导致抑郁症的模型，和CUMS模拟环境中微小而持续的应激导致抑郁症的模型，观察在不同应激下遗传背景对抑郁样行为与中医证候表型的影响差异。

Balb/c品系小鼠在两种造模条件下，都表现出抓力下降，掌纹血色比值下降以及皮毛评分上升的证候指标变化。在皮质酮造模中，旷场行为与新奇环境摄食抑制行为均无变化，而糖水偏好变化尽管未达到显著性，但是有抑郁样表现的趋势。比较而言，CUMS造模导致糖水偏好显著下降的抑郁样表型，以及新奇环境摄食抑制行为变化表现出的焦虑样表型。而且旷场中活动总路程和负重游泳时间都显著增加。根据这些指标，可以看出在CUMS模型下，Balb/c品系表现为抑郁伴随焦虑的疾病状态，而在皮质酮模型下，此品系可能处于阈下抑郁状态，或者只有部分动物获得了抑郁样表型。即便如此，Balb/c小鼠在两种模型下都表现为抓力和掌纹血色度的下降以及皮毛评分的增加，类似于气虚证。抓力下降是气虚的表现，掌纹血色度的下降则体现血虚。肺为主气脏腑，又主皮毛，气为血之帅，气虚则力乏，血行不足，失于宣发敷布津液荣养皮毛，皮毛失华。Balb/c小鼠的气虚证候在疾病尚不明显时就已出现，也从侧面支持了中医依据证候治未病思想的合理性。而此证候在疾病前后都显著表现出来，既体现出证候的相对稳定性，也表现出证候的品系依赖性。

129/S1品系小鼠在两种造模条件下，都表现出糖水偏好的显著下降的抑郁样表型，在新奇环境摄食抑制行为中都表现出焦虑样表型。另外，皮毛评分也都显著升高。皮质酮造模导致负重游泳时间和强迫游泳漂浮时间均增加，CUMS造模导致旷场总路程增加和负重游泳时间的下降。两种造模方式都可有效诱发129/S1小鼠抑郁焦虑样行为，提示在此品系中，皮质酮在介导慢性应激产生抑郁疾病中可能发挥非常重要的作用。在证候上，皮质酮造模引起皮毛评分提高，而抓力与血色度不变，负重游泳时间甚至显著延长，提示皮毛失华可能不是由气血亏虚导致。根据其强迫游泳漂浮时间的延长，表现为应激后气行不畅而生郁滞的特点，可以辨为气郁证候。类似地，在CUMS造模中，抓力不变，旷场总路程成倍增加，表现为气盛冲动急躁，加上不动时间（悬尾）增加，也可辨为气郁或肝气郁证[17]。其负重游泳水平下降，提示抗疲劳力量有所不及，既有可能是气郁的表现，也可能是向气郁化火，炼灼肾精等转化。总的来说， 129/S1品系在两种造模条件下都表现为抑郁样行为和气郁证候。相对于Balb/c在两种造模中都有抓力和血色度的变化，129/S1品系都没有上述表现，也提示该证候表现的品系依赖性。

此研究首次使用不同的造模方法，发现两种造模方式在同一品系小鼠上所表现出的病证一致性较好，提示抑郁症证候的差异与遗传背景关系密切，可以作为中医证候的本质研究新的研究思路与方法。此外，本文从遗传角度进行病证结合研究，提供了重复性好，客观性强，可量化与验证的病证结合研究方法。尽管如此，仍有若干问题未在本文解决。例如，证候如何随病程进一步进展而变化。我们在动物模型上初步观察到气虚抑郁和（肝）气郁抑郁两种病证，也是临床上抑郁症病人中出现频率最多的证候[4，5]，后期应进行方药反证[17]，强化该病证的证据。

4 结语

早在上世纪80年代末就有学者提出中医基础研究需要病证结合，已取得了一定的成果。但是，病证结合在临床实践与基础研究中某些基本的问题，例如证候与疾病到底关系如何的问题研究尚不充分。通过不同品系在不同抑郁症模型中病证表现的比较，研究结果支持证候具有遗传稳定性的假设。以遗传品系为基础的病证研究，重复性佳，指标量化，可以作为病证结合研究的一种方法加以推广。可以在此基础上，利用小鼠全基因组关联分析等方法，从一定数量的遗传群体鉴定出特异性地影响抑郁症证候的基因及网络，以阐释病证深刻的现代生物学本质。

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An Empirical Study on Strain-Dependent Phenotypes of Traditional Chinese Medicine Syndrome of Depression

Zhou Xin1, Xue Wenda1, Li Shouxue1, Zhang Hailou1, Xia Baomei1, Qu Miao2, Chen Gang1, Tang Qisheng2

(1. Center for Translational Systems Biology and Neuroscience, Key Laboratory of Integrative Biomedicine for Brain Diseases, School of Basic Biomedical Science, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China; 2. The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

The essence of the relationship between disease and traditional Chinese medicine (TCM) syndrome is one of the basic problems in the research of TCM. Based on the principle of genetic (innate endowment) involvement in determining disease-syndrome, this study aimed to analyze the effects of different mouse strains on the TCM syndrome of depression. Repeated injections of corticosterone and chronic unpredictable mild stress (CUMS) were used for modeling depression in two inbred strain mice, Balb/c and 129/S1. Animals were tested for sucrose preference, tail suspension, forced swimming, novelty suppressed feeding, open filed activities, as well as fur condition, degree of redness in the palm, grasping force, and loaded swimming tests for TCM syndrome phenotypes. The results showed that male Balb/c strain mice exhibited subthreshold depressive-like behavior and depressive-like behavior respectively in two models. However, grasping force and degree of redness in the palm in both models indicated qi deficiency syndrome. Male 129/S1 mice showed depressive-like behavior in both models. Meanwhile, the behavior despair indicated the qi stagnation syndrome in both models. In both strains and both models, the fur condition was worsen, suggesting the phenotype was associated with both syndromes. It was concluded that TCM syndrome of depression was strain-dependent, and to some extent, independent of the disease model. This study lays a foundation for further utilization of modern technologies such as genome-wide association study to investigate the relationship between disease and TCM syndrome.

Integration of disease and TCM syndrome, depression, strain, corticosterone, chronic unpredictable mild stress model

10.11842/wst.2016.02.001

R277.7

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：朱黎婷 王 晶）

2016-01-23

修回日期：2016-01-26

＊ 国家自然科学基金委青年基金资助项目（81403041）：京大戟中稀有二萜类成分的抗肿瘤活性及构效关系研究，负责人：陶伟伟；国家自然科学基金委面上资助项目（81473658）：益肾调气法对卒中后抑郁、焦虑，痴呆发生发展的防治作用研究，负责人：唐启盛；江苏省自然科学基金委青年资助项目（BK20140962）：基于GWAS分析策略研究越鞠丸抗抑郁作用的分子机制研究，负责人：薛文达；江苏省自然科学基金委面上资助项目（BK20151568）：PACAP介导越鞠丸快速抗抑郁作用研究，负责人：陈刚；南京中医药大学自然科学基金青年资助项目（13XZR006）：基于“五志化火”探讨栀子抗抑郁作用特点及其机制研究，负责人：周欣；江苏省委双创项目（2013455）：中医辨证治疗抑郁症的系统生物学研究，负责人：陈刚。

＊＊ 通讯作者：陈刚，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：抑郁症的病证及其治疗机制；唐启盛，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：抑郁症辨证论治研究。