分子对接法虚拟筛选桂枝茯苓胶囊抗子宫肌瘤的潜在活性成分＊

2016-03-13范麒如王振中马宏跃

世界科学技术-中医药现代化 2016年2期

范麒如，王振中，马宏跃，萧伟＊＊

（1. 江苏康缘药业股份有限公司连云港 222001；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室连云港 222001；3. 中国药科大学生命科学与技术学院南京 210009；4. 南京中医药大学药学院南京 210046）

范麒如1,2,3，王振中1,2，马宏跃4，萧伟1,2＊＊

目的：运用计算机虚拟对接技术筛选桂枝茯苓胶囊中抗子宫肌瘤的潜在活性成分。方法：选择与子宫肌瘤发病机制高度相关的雌激素受体ER、CDK2、EGFR为靶点，采用软件Molegro Virtual Docker，以选择性抑制剂与靶点的共结晶复合物作为受体模板，建立靶点的活性位点，与桂枝茯苓胶囊中的35种已知主要成分进行分子对接。结果：以选择性抑制剂与靶点的MD Score的1/2为阈值，筛选得到13个化合物与靶点存在较强的相互作用。结论：桂枝茯苓胶囊多个成分能与ER、CDK2，EGFR成功对接，这可能是桂枝茯苓胶囊抗子宫肌瘤作用的活性成分。

桂枝茯苓胶囊子宫肌瘤分子对接虚拟筛选 ER CDK2 EGFR

桂枝茯苓胶囊源于东汉张仲景《金匮要略》中桂枝茯苓丸，经现代工艺提升改革而来，具有活血化瘀、消徵散结之功效。临床上常用于原发性痛经、卵巢囊肿、子宫肌瘤、慢性盆腔炎等妇科血瘀证的治疗[1-4]。流行病学研究发现，子宫肌瘤（Uterine Leiomyoma，UtLM）是女性生殖器中最常见的良性肿瘤，多发于30-50岁妇女，发病率为20%-30%，占女性生殖器良性肿瘤发病总量的52%[5]。子宫肌瘤的发病机制至今仍不明确。现代医学认为，子宫肌瘤是激素依赖性肿瘤，与基因、细胞增殖与凋亡、细胞信号传导途径异常、雌激素及其受体、孕激素及其受体、催乳素、生长因子等因素有关[6]。关于桂枝茯苓胶囊治疗子宫肌瘤的物质基础及作用机制未见报道。因此，本研究以子宫肌瘤发生高度相关的雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）、细胞周期蛋白依赖激酶（Cyclin-Dependent Kinase 2，CDK2）、表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）为靶点，采用计算机分子对接（Molecular Docking，DOCK）技术，研究桂枝茯苓胶囊中已知的35种主要成分与靶点的对接信息，以期为阐明桂枝茯苓胶囊治疗子宫肌瘤的物质基础及作用机制研究提供依据。

1 方法

1.1 受体的晶体结构

选择雌激素受体（PDB code:3ERT）与抑制剂Tamoxifen复合物的晶体结构，CDK2（PDB code: 1CKP）与激酶抑制剂Purvalanol B复合物的晶体结构，EGFR（1XKK）与激酶抑制剂Lapatinib共结晶复合物[9]作为受体模板，作为计算机分子对接的受体模型，使用软件MVD进行对接研究[7-9]。

1.2 配体构建

桂枝茯苓胶囊是由桂枝Ramulus Cinnamomi，茯苓Poria，桃仁Semen Persicae，丹皮Cortex Moutan，白芍Paeonia Radix 5味药材提取精制而成。本研究选择桂枝茯苓胶囊中35种主要可检测成分作为研究对象，其中包括桂皮醇、桂皮醛、肉桂酸、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、羟基苯甲酰芍药苷、羟基芍药苷、丹皮酚、茯苓酸、苦杏仁苷、没食子酸、山柰酚、山柰酚-3-O-葡糖糖苷、1，2，3，6-O-四没食子酰葡萄糖、1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖、香豆素、7-羟基香豆素、原儿茶酸、槲皮素、丁香酸、儿茶素等，化合物的平面化学结构采用ISIS-Draw软件画图，并导出为mol格式；利用小分子化合物在线结构转换服务，将其二维化学结构转换成三维立体结构。采用Open Babel软件＊＊ http://openbabel.sourceforge.net/＊＊ http://www.molegro.com/products.php对三维结构进行加氢、加电荷之后将pdb文件保存成mol2文件格式，用于分子对接研究。

1.3 对接程序

分别以3ERT晶体结构中抑制剂Tamoxifen （OH-600），1CKP晶体结构中选择性抑制剂Purvalanol B（PVB-299），1XKK晶体结构中选择性抑制剂Lapatinib（FMM-91）为中心，选择距离10Å以内的所有氨基酸基团组成受体活性筛选位点，采用标准Molegro Virtual Docker＊＊＊ http://openbabel.sourceforge.net/＊＊ http://www.molegro.com/products.php对接程序进行分子对接，基于对接的分子能量对各种结合模式进行评分，以最低的对接能量确定分子的对接构像。筛选之前，分别通过将配体OH-600、PVB-299、FMM-91抑制剂对接到相应的靶蛋白活性位点，来确证MVD对接程序的有效性[10]。以选择性抑制剂与靶点的MD Score的1/2为阈值，筛选有潜在活性的化合物。

2 结果

2.1 靶蛋白与抑制剂的分子对接结果

3ERT、1CKP、1XKK与各对应抑制剂对接的模拟构象与真实X-晶形衍射的构象进行比对，两种构象间所有原子的均方根偏差（Root Mean Square Deviation，RMSD）小于1 Å，表明分子对接模拟成功，对接的能量值如表1 所示。

表1 3ERT、1CKP、1XKK与各对应抑制剂的分子对接参数

2.2 桂枝茯苓胶囊化学成分与3ERT、1KCP、1XKK分子对接筛选结果

将桂枝茯苓胶囊35个主要可测成分与3个靶点对接得分与相应抑制剂得分进行比较，得到13个命中化合物，其中7个化合物能结合于2个或3个靶点，6个化合物仅作用于1个靶点，命中化合物对接的能量如表2、表3、表4所示。

3 讨论

分子对接法（Molecular Docking Method）是一种基于受体大分子三维结构来寻找先导化合物的重要方法，是计算机辅助药物分子设计中最为重要的方法之一。对接计算时，将配体分子放到受体活性位点，然后按照几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则来实时评价配体与受体相互作用，该方法已有成功用于中药复方活性成分筛选和作用机制研究的报道[11-13]。

大量实验研究表明，子宫肌瘤为激素依赖性肿瘤，较正常子宫肌层相比，子宫肌瘤对雌激素具有高应答性，肌瘤内ERmRNA及其蛋白的表达高于周围正常肌组织，局部形成的异常高的E2及ER 环境，可能是诱发子宫肌瘤的主要因素[14,15]。CDK2调节细胞周期S期染色体DNA的复制，当长期不利因素刺激时（细胞周期的驱动力失控或者监控检查机制受损时）会异常表达，进而引起细胞周期紊乱导致细胞异常增殖形成肿瘤。有报道称，CDK2在肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等肿瘤中高度表达，是基于细胞周期的小分子抗肿瘤

药物研究的重要靶点[16]。在肌瘤组织中，CDK2明显高于正常子宫肌组织[17]。抑制CDK2是治疗子宫肌瘤的一个有效途径；EGFR是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受体，与生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）构成EGF/EGFR信号通路，该通路被激活后可以将细胞外的信号传递到细胞内和细胞核，促进细胞增殖，与多种肿瘤的产生机制有关[18-20]。有研究证明，在子宫肌瘤组织中EGFR表达显著[21]。本文选择上述3个靶点采用分子对接方法虚拟筛选桂枝茯苓胶囊中抗子宫肌瘤的潜在活性成分，结果显示：胶囊中多种成分能与ER、CDK2、EFGR结合。其中儿茶素与ER结合见图1，该结果与已有报道的儿茶素调节雌激素活性一致[22]。槲皮素与CDK2、EGFR结合见图2，此结果与文献报道活性一致[23,24]。

表2 桂枝茯苓胶囊命中化合物与3ERT的分子对接参数

表3 桂枝茯苓胶囊命中化合物与1KCP的分子对接参数

表4 桂枝茯苓胶囊命中化合物与1XKK的分子对接参数

小结：本研究采用分子对接方法虚拟筛选桂枝茯苓胶囊中具有抗子宫肌瘤作用的潜在活性成分，在一定程度上揭示了桂枝茯苓胶囊抗子宫肌瘤的物质基础和作用机制，对验证实验研究具有启示意义。

图1 儿茶素与ER结合图

图2 槲皮素与CDK2、EGFR结合图

参考文献

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Virtual Screening of Potential Active Ingredients in Guizhi Fuling Capsule with Molecular Docking

Fan Qiru1, 2, 3, Wang Zhenzhong1, 2, Ma Hongyue4, Xiao Wei1, 2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of Pharmaceutical New-tech for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China; 3. Faculty of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 4. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

The study aimed to explore the potential anti-hysteromyoma active ingredients of Guizhi Fulingcapsule (GZFLC) through virtual screening with molecular docking. According to their crystal structures, ER (PDB: 3ERT) and its selective inhibitor CDK2 (PDB: 1CKP) and EGFR (PDB: 1XKK) were important targets which had close relationship with hysteromyoma. A molecular docking study was performed by Molegro Virtual Docker program to find out potential active ingredients for investigating anti-hysteromyoma effects of GZFLC. The results showed that thirteen compounds can bind to the targets. It was concluded that several potential active in gredients were docked with ER, CDK2 and EGFR successfully, which offered to be active ingredients that performed antihysteromyoma effects of GZFLC.

Guizhi Fuling capsule, uterine leiomyoma, molecular docking, virtual screening, ER, CDK2, EGFR

10.11842/wst.2016.02.027

R283

（责任编辑：马雅静张志华，责任译审：朱黎婷王晶）

2014-08-25

修回日期：2014-12-19

＊科学技术部国家重大新药创制专项（2013ZX09402203）：现代中药创新集群与数字制药技术平台，负责人：王振中。

＊＊通讯作者：萧伟，本刊编委，博士，研究员，主要研究方向：中药新剂型的研究与开发。