应用形态学及动力学参数筛选优质囊胚的研究进展

魏明明，何玉洁



·综述·

应用形态学及动力学参数筛选优质囊胚的研究进展

魏明明，何玉洁△

囊胚的质量在选择性单囊胚移植（elective single blastocyst transfer，eSBT）中至关重要，移植1个优质的囊胚，可以有效降低多胎率并保持较高的临床妊娠率。目前，囊胚质量的评价方法仍以形态学为主。传统的形态学评分法对各形态学参数进行综合评分，得分高的囊胚质量较优。但当有2个以上综合评分相同的囊胚可供移植时，需要新的指标来选择出最具有发育潜力者。研究显示，囊胚的3个相互独立的形态学参数：内细胞团（inner cellmass，ICM）、滋养层（trophectoderm，TE）和囊胚扩张程度三者对妊娠结局的预测价值不同，可以为囊胚的进一步筛选提供参考。近年来，应用延时（time-lapse）成像技术可以动态观察胚胎发育的全过程，原核期、卵裂期以及囊胚期的动力学参数成为了囊胚质量评价的新指标。综述应用形态学及动力学参数筛选优质囊胚的研究进展。

受精，体外；胚胎移植；囊胚；形态发生；动力学

【Abstract】The blastocyst quality is very important for the elective single blastocyst transfer（eSBT）.The multiple pregnancy rate can be effectively reduced，and the clinical pregnancy rate can be kept at a higher level，by transplanting a high-quality blastocyst.At present，the main method to evaluate the quality of blastocysts is morphology.The morphological parameters were comprehensively scored by the traditionalmorphological scoring method，which means that the blastocystwith higher score is of the better quality.However，when there aremore than two blastocysts with the same score，new indicators are necessary for embryologists to select the blastocyst with the most developmental potential for transplantation.Three independent morphological parameters of blastocyst，inner cell mass（ICM），trophectoderm（TE）and degree of blastocyst expansion with the different predictive value for the pregnancy outcomes，can provide additional references for the further screening of the blastocyst.In recent years，the whole process of embryonic development can be observed dynamically by timelapse imaging technology.The kinetic parameters of pronuclear stage，cleavage stage and blastocyst stage were tried as the new index for evaluating the quality of embryo.In this article，we reviewed the research progress on the screening high quality blastocyst bymorphological and kinetic parameters.

【Keywords】Fertilization in vitro；Embryo transfer；Blastula；Morphogenesis；Kinetics

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：308-312）

随着辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）日渐成熟，体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的胚胎移植率、着床率、妊娠率均有明显的提高。由于囊胚比卵裂期胚胎更加符合妊娠生理，因此有更好的妊娠结局［1］。为避免导致多胎妊娠，临床工作者逐渐认可选择性单囊胚移植（elective single blastocyst transfer，eSBT）［2］。在eSBT中，囊胚质量关系到妊娠结局，所以如何有效评价囊胚质量，选择一个优质囊胚进行移植，变得尤为重要。目前囊胚的评价方法包括形态学、代谢组学、基因组学，目前常用的是Gardner等［3］提出的囊胚标准形态学评分方法。由于可选择囊胚数量的增加，各个独立的形态参数对临床妊娠的重要性也逐渐引起辅助生殖领域的重视。并且，早期的囊胚标准形态学评分均是在离散时间点对囊胚进行观察，这限制了选择最佳胚胎的信息量。而近年兴起的延时（time-lapse）成像技术则弥补了这个不足。一些在胚胎发育过程中新的动力学指标有助于胚胎学家更有效地评价胚胎质量，并且在临床上取得了一定的效果。

作者单位：030001太原，山西医科大学临床医学院（魏明明）；山西医科大学第一医院（何玉洁）

通信作者：何玉洁，E-mail：hyj7007@163.com

△

审校者

1　形态学参数综合评分

卵母细胞受精后第5天（D5）有可能发育到囊胚期，细胞间开始形成囊腔，其内充满液体。形成囊胚后，细胞开始分化，形成滋养层（trophectoderm，TE）细胞和内细胞团（inner cellmass，ICM）细胞两种不同的细胞成分。由于不同质量的胚胎发育速度不一致，有的胚胎可能在受精后D6、D7甚至更晚才形成囊胚。已有研究证实，较早形成的囊胚发育潜能更佳，移植后可获得更好的妊娠结局［4-5］。目前，国内外的共识是在受精后D5～D6对囊胚进行筛选及移植。

Dokras等［6］最早提出了一个简易囊胚评分系统，根据囊胚的发育速度将囊胚分为3级。1级：D5或D6形成的ICM和TE、清晰的扩张囊胚；2级：比1级囊胚发育延迟24～48 h，D6或D7形成与1级囊胚形态相似的胚胎；3级：体外培养5～7 d形成的囊胚发育差、ICM和TE内有退化区域的囊胚。该方法虽然简单，却是一个直观完整的指导囊胚筛选的形态学评分体系，为此后囊胚形态学评分的发展奠定了基础。

2000年Gardner等［3］提出了一个综合囊胚扩张程度、ICM和TE发育的形态学评分方法。用1～6的连续数字将囊胚按照扩张程度和孵化状态进行区分，已经扩张的囊胚，则进一步对ICM和TE进行质量分级，均分成A、B、C三级。并通过实验证实移植一个高评分的囊胚，可以在保持妊娠率较高的同时降低多胎率。此后，有研究也证实了此囊胚评分方法的有效性［7］。Gardner评分法作为囊胚形态学评分及研究的传统标准，在国内外广泛沿用至今。

2　独立形态学参数

虽然有研究表明2个或2个以上形态学参数得分最高的囊胚进行移植，可以实现最高的植入率［7］。但3个形态学参数具有独立性，ICM将来发育为胎儿，TE发育为与母体连接的胎盘，囊胚扩张程度也一定程度上体现出胎儿的发育潜能。所以，在eSBT中，当有多个综合评分相同但独立形态学参数评分不同的囊胚可供移植时，即当有Gardner综合评分为4AB（分别代表囊胚扩张程度，ICM和TE）与4BA的囊胚同时存在，给囊胚的选择带来了困惑。这些囊胚可能在发育潜能上有一定差异，当选择最佳囊胚时可以利用这种差异。但Gardner评分法在对囊胚的发育潜能了解上具有局限性，因此要作出这一决定，有必要了解每个形态参数对囊胚植入过程的贡献。

2.1ICM ICM的研究曾经成为预测囊胚移植成功的关键，并且认为ICM是囊胚移植后临床结局的最好预测因子［8-9］。2001年，Richter等［8］研究发现，囊胚扩张程度和TE数量与种植率无关，培养至D5拥有最佳大小和形状的ICM的囊胚植入率最高。提示ICM的数量高度显示囊胚植入潜能，但其研究的重点放在用来定义一个最优的ICM，TE形态只是基于横断面的细胞计数，不包括评价TE的大小和形状，影响到了结果的判断价值。之后，一项以Gardner评分为基础的研究，比较了3个独立形态学参数对妊娠结局的预测作用后提出，只有ICM等级与早期妊娠丢失率显著相关，该研究认为移植时选择ICM A级的囊胚可显著减少早期流产发生，提示了在Gardner评分上ICM预测囊胚能力的重要性［10］。

2.2TE近年更多的研究认为TE评分较ICM更能预测临床结局。2011年，Ahlström等［11］研究发现，TE细胞形态是预测出生结局最重要的形态学参数。虽然囊胚腔扩张和ICM形态在进行单因素和多因素分析中是显著的预测因子，但在多元Logistic回归分析中并不是活产的显著预测因子。Kovacic等［9］在研究中描述了一个囊胚分级系统，依据囊胚的3个独立形态学参数将囊胚分为8个形态等级（B1～B8），B1～B8的囊胚移植结果显示了植入率与出生率的显著降低。其结论是一个正常的ICM是囊胚植入的最重要参数，但从囊胚B1到B2的分类中，唯一的形态差异是TE的等级差别，这种等级差别导致了活产率降低13%（45.2%vs.32.8%）。同样，Ahlström等［11］的研究也指出，当TE形态从A下降到B时，活产率下降16% （49.9%vs.33.9%），这说明当一个正常的ICM存在时，TE可影响出生率。此后有研究提出，更好的TE形态、更年轻的患者以及囊胚的进一步培养都可以获得较高的临床妊娠率和活产率，但TE形态是最佳囊胚移植的关键因素［12］。且有国外学者对1 087个冷冻SBT中3个独立形态学参数对妊娠结局的预测能力进行研究后发现，仅TE形态与临床持续妊娠率和流产率有关［13］。有研究对囊胚扩张程度进行限定，将TE 与ICM对妊娠结局的预测能力进行了比较，也认为TE是最重要的预测因子［14］。一项对194个整倍体胚胎和238个非整倍体胚胎的研究发现，TE形态可能与非整倍体有关。相对于好的TE形态，TE形态较差的囊胚非整倍体发生率上升2.5倍，且这种对非整倍体的影响出现在囊胚期而不是卵裂期，凸显了TE形态在囊胚质量评价中的优势［15］。

2.3囊胚扩张程度2013年，Thompson等［12］对3 151例新鲜SBT进行了回顾性分析发现，除TE形态是最佳囊胚移植的关键因素外，囊胚扩张程度也可在一定程度上预测出生结局。但有研究结果显示，囊胚扩张程度对妊娠结局无显著的预测价值［11，13］。由于解冻周期过程比新鲜周期过程更复杂，针对此过程是否会对囊胚产生影响，Ahlström等［16］对预冻和解冻后囊胚的重新扩张程度进行了研究，认为预冻囊胚扩张程度、TE等级和重新扩张程度是解冻后囊胚移植出生率的最重要预测因素。但解冻后囊胚重新扩张程度是否对妊娠结局具有预测作用，由于研究较少，目前无比较的价值，这也是未来囊胚形态学研究关注的重点。

许多IVF实验室没有适当的证据，ICM一直被认为是最重要的预测妊娠/生育的因素［8-10］，主要理由是ICM细胞可以引起胎儿生长。然而，近年的研究表明，在囊胚移植过程中，TE对临床结局的预测价值更加显著，如果没有一个功能性TE建立的着床，ICM在母体内的发展就很难发生［11-16］。所以，在eSET中，当有综合评分为4AB和4BA的囊胚可供选择时，应该优先选择4BA的囊胚进行移植。而囊胚扩张程度是否具有预测价值，仍在不断探索中。

3动力学参数

胚胎早期发育主要经历原核期、卵裂期及囊胚期三个连续的过程。囊胚标准形态学评分在静态观察下对囊胚进行筛选，一定程度上限制了对优质囊胚的判断。近年来，延时（time-lapse）成像技术逐渐应用于胚胎培养并得到不断改进［17］，最新的延时成像技术已可以在尽量减少对胚胎影响的同时，动态地观察胚胎早期发育的全过程。动物模型研究提示：植入前胚胎的行为特点是反映囊胚形成能力、囊胚质量以及妊娠结局的一个重要依据［18-19］。随着该项技术在临床的推广应用，越来越多的研究期望从中找出具有预测囊胚质量以及妊娠结局价值的动力学指标，以弥补现有囊胚形态评分的不足。

3.1原核期、卵裂期动力学参数2008年，Lemmen等［20］报道了采用延时成像技术观察胚胎由受精卵到卵裂期的相关动力学参数的研究，认为原核消失时间早的胚胎发育潜能更好。此后，有研究用延时成像观察了受精后14～15 h、16～18 h、19～20 h这3个时间段内原核核仁前体分布情况的动态变化，发现在3个时间间隔的核仁分布发生着不断改变，认为常规19～20 h静态观察，可能造成对胚胎质量的误判，实时动态观察法更为可靠，可以获得更多对胚胎筛选有价值的观测指标［21］。

2010年，Wong等［22］的研究指出，胚胎前3次分裂的时间能够准确地预测囊胚形成的能力，提示了囊胚的形成与卵裂期动力学参数有关；2012年，Hlinka等［23］的研究中，连续观察胚胎裂解到16-细胞阶段，提出能够成功妊娠的囊胚在前期的培养中有一致的卵裂模式和间隔；有研究对延时成像中观察到的动力学参数进行了比较，结果显示从2-细胞到8-细胞分裂的同步性是预测囊胚形成和质量的最佳指标［24］；Hashimoto等［25］将形态学综合评分与动力学参数相结合，比较了囊胚质量与完成第2次及第3次有丝分裂所需时间，结果显示评分高的囊胚比评分低的囊胚完成2次分裂所需的时间短；Cruz等［26］的研究也指出，囊胚的形态学参数与前期胚胎发育的动力学参数有关，卵裂期胚胎的动力学参数影响囊胚质量的评价。另有研究表明卵裂期细胞碎片也一定程度上影响了囊胚的质量和妊娠结局［27］。

随着越来越多与胚胎质量和妊娠结局相关的动力学参数的发现，有学者建立了一个基于延时成像动力学参数预测囊胚发育的多因素回归模型，模型中纳入的动力学参数包括由受精开始到胚胎分裂成2，3，4和5卵裂球的连续的时间过程，以及每一个过程之间的时间间隔，结果显示发育到囊胚的各胚胎预测参数的大小与没有发育到囊胚阶段相比有显著差异［28］。最近Milewski等［29］建立了一个预测囊胚移植后妊娠结局的动力学参数回归模型，结果发现植入组与非植入组的参数差异显著。以上模型的建立，体现了动力学参数包含的信息对囊胚质量及妊娠结局的重要价值，可以为优质囊胚的筛选提供更多的帮助。

3.2囊胚期动力学参数近年随着胚胎培养技术及延时成像技术的不断成熟，逐渐发现了不易观察到的囊胚期动力学参数。研究者开始尝试将这些参数纳入预测囊胚发育潜能及妊娠结局的模型中，探寻更加全面的胚胎筛选方式。Motato等［30］建立了一个预测囊胚形成及植入的动力学参数回归模型，结果显示囊胚扩张时间可以预测囊胚植入。另有研究显示，囊胚扩张时间是囊胚质量的最佳预测参数，并提出筛选优质囊胚的动力学参数模型应包含囊胚扩张时间［31］。

在囊胚期的观察中，会发现部分囊胚的囊腔收缩（皱缩），持续时间通常不超过1 h。传统静态观察方式通常是在囊胚再扩张后进行评价，忽略了这一时期的动力学改变。而早期已有研究对小鼠囊胚的收缩进行延时观察并发现，囊胚在形成10 h后有不同程度的重复收缩，弱的收缩（体积减少＜20%）有利于囊胚孵化，而强大的收缩（体积减少≥20%）抑制孵化，提示了囊胚的收缩可能对胚胎的发育能力产生影响［32］。Marcos等［33］应用延时成像观察了囊胚的崩溃（强烈收缩）过程（囊胚滋养层细胞表面自透明带分离≥50%）及胚胎种植率，结果显示崩溃的囊胚相比于无崩溃的囊胚植入率显著降低（35%vs. 48.5%），认为囊胚崩溃模式可以作为囊胚筛选的额外标准。但近期有学者对囊胚崩溃与出生率的相关性进行了多因素分析后发现，囊胚崩溃不是显著的预测因素，提出囊胚崩溃模式不应单独作为生殖预后的预测因素，应与预测生殖结局的其他动力学变量协同考虑［34］。

有研究指出：无论是通过静态或动态观测，囊胚培养应用的增加，可能放缓基于胚胎发育早期阶段质量评价指标的研究［35］。因此，随着目前可移植囊胚数量的增加，囊胚培养阶段的动力学参数将是未来研究的重点，也将为优质囊胚的筛选提供更多的参考。

4结语

综上所述，在囊胚质量的评价上，形态学仍是一个不可忽略的重要方法。eSBT中，优质囊胚的选择应从形态学评价开始。通过进一步的前瞻性研究，与独立形态参数对预测妊娠结局的重要性上达成统一，为进一步的筛选提供帮助。2011年欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）对卵母细胞和胚胎形态学评价进行了总结，为确定植入潜力最高的胚胎，提出了一种以形态学为基础，联合延时成像分析新参数的胚胎质量评价模式［36］。这种模式在囊胚质量的评价上结合了形态学和动力学参数后更加完善，但要逐渐应用于临床还需进一步的研究。

［1］Zander-Fox DL，Tremellen K，Lane M.Single blastocyst embryo transfermaintains comparable pregnancy rates to double cleavagestage embryo transfer but results in healthier pregnancy outcomes ［J］.AustN ZJObstetGynaecol，2011，51（5）：406-410.

［2］Maheshwari A，Griffiths S，Bhattacharya S.Global variations in the uptake of single embryo transfer［J］.Hum Reprod Update，2011，17 （1）：107-120.

［3］Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome:towards a single blastocyst transfer［J］.FertilSteril，2000，73（6）：1155-1158.

［4］Elgindy E，Elsedeek MS.Day 5 expanded blastocysts transferred on same day have comparable outcome to those left formore extended culture and transferred on day 6［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29（10）：1111-1115.

［5］Levens ED，Whitcomb BW，Hennessy S，et al.Blastocyst development rate impacts outcome in cryopreserved blastocyst transfer cycles［J］.FertilSteril，2008，90（6）：2138-2143.

［6］Dokras A，Sargent IL，Barlow DH.Human blastocyst grading:an indicator of developmental potential？［J］.Hum Reprod，1993，8 （12）：2119-2127.

［7］Balaban B，Yakin K，Urman B.Randomized comparison of two differentblastocystgrading systems［J］.Fertil Steril，2006，85（3）：559-563.

［8］Richter KS，Harris DC，Daneshmand ST，etal.Quantitative grading of a human blastocyst:optimal inner cellmass size and shape［J］. FertilSteril，2001，76（6）：1157-1167.

［9］Kovacic B，Vlaisavljevic V，Reljic M，etal.Developmental capacity of different morphological types of day 5 human morulae and blastocysts［J］.Reprod Biomed Online，2004，8（6）：687-694.

［10］Van den Abbeel E，Balaban B，Ziebe S，et al.Association between blastocystmorphology and outcome of single-blastocyst transfer［J］. Reprod Biomed Online，2013，27（4）：353-361.

［11］Ahlström A，Westin C，Reismer E，et al.Trophectoderm morphology:an important parameter for predicting live birth after single blastocyst transfer［J］.Hum Reprod，2011，26（12）：3289-3296.

［12］Thompson SM，Onwubalili N，Brown K，et al.Blastocyst expansion score and trophectoderm morphology strongly predict successful clinical pregnancy and live birth following elective single embryo blastocyst transfer（eSET）:a national study［J］.JAssist Reprod Genet，2013，30（12）：1577-1581.

［13］Honnma H，Baba T，Sasaki M，et al.Trophectoderm morphology significantly affects the rates of ongoing pregnancy andmiscarriage in frozen-thawed single-blastocyst transfer cycle in vitro fertilization［J］.FertilSteril，2012，98（2）：361-367.

［14］甄璟然，王雪，孙正怡，等.复苏单囊胚移植周期中囊胚形态学评分对临床妊娠的影响［J］.生殖医学杂志，2014，23（1）：7-10.

［15］Alfarawati S，Fragouli E，Colls P，et al.The relationship between blastocyst morphology，chromosomal abnormality，and embryo gender［J］.Fertil Steril，2011，95（2）：520-524.

［16］Ahlström A，Westin C，Wikland M，etal.Prediction of live birth in frozen-thawed single blastocyst transfer cycles by pre-freeze and post-thawmorphology［J］.Hum Reprod，2013，28（5）：1199-1209.

［17］石江霞，张硕屏，龚斐.延时摄像在人类辅助生殖技术中的应用［J］.国际妇产科学杂志，2013，40（4）：358-363.

［18］Pribenszky C，Losonczi E，Molnár M，et al.Prediction of in-vitro developmental competence of early cleavage-stagemouse embryos with compact time-lapse equipment［J］.Reprod Biomed Online，2010，20（3）：371-379.

［19］Weinerman R，Feng R，Ord TS，et al.Morphokinetic Evaluation of Embryo Development in a Mouse Model:Functional and Molecular Correlates［J］.BiolReprod，2016，94（4）：84.

［20］Lemmen JG，Agerholm I，Ziebe S.Kinetic markers of human embryo quality using time-lapse recordings of IVF/ICSI-fertilized oocytes［J］.Reprod Biomed Online，2008，17（3）：385-391.

［21］Montag M，Liebenthron J，Köster M.Which morphological scoring system is relevant in human embryo development？［J］.Placenta，2011，32（Suppl3）：S252-S256.

［22］Wong CC，Loewke KE，Bossert NL，et al.Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage［J］.Nat Biotechnol，2010，28 （10）：1115-1121.

［23］Hlinka D，Kal′atováB，UhrinováI，et al.Time-lapse cleavage rating predicts human embryo viability［J］.Physiol Res，2012，61 （5）：513-525.

［24］CetinkayaM，PirkeviC，YelkeH，etal.Relative kinetic expressions defining cleavage synchronicity are better predictors of blastocyst formation and quality than absolute time points［J］.JAssistReprod Genet，2015，32（1）：27-35.

［25］Hashimoto S，Kato N，Saeki K，et al.Selection of high-potential embryos by culture in poly（dimethylsiloxane）microwells and time-lapse imaging［J］.Fertil Steril，2012，97（2）：332-337.

［26］Cruz M，Garrido N，Herrero J，et al.Timing of cell division in human cleavage-stage embryos is linked with blastocyst formation and quality［J］.Reprod Biomed Online，2012，25（4）：371-381.

［27］Chavez SL，Loewke KE，Han J，et al.Dynamic blastomere behaviour reflects human embryo ploidy by the four-cell stage［J］. NatCommun，2012，3：1251.

［28］Milewski R，Kuc′P，Kuczyńska，et al.A predictive model for blastocyst formation based on morphokinetic parameters in timelapsemonitoringofembryo development［J］.JAssist Reprod Genet，2015，32（4）：571-579.

［29］Milewski R，Milewska AJ，Kuczyńska A，et al.Do morphokinetic data sets inform pregnancy potential？［J］.JAssist Reprod Genet， 2016，33（3）：357-365.

［30］Motato Y，de Los Santos MJ，Escriba MJ，et al.Morphokinetic analysis and embryonic prediction for blastocyst formation through an integrated time-lapse system［J］.Fertil Steril，2016，105（2）：376-384.e9.

［31］Storr A，Venetis CA，Cooke S，et al.Morphokinetic parameters using time-lapse technology and day 5 embryo quality:a prospective cohort study［J］.JAssist Reprod Genet，2015，32（7）：1151-1160.

［32］Niimura S.Time-lapse videomicrographic analyses of contractions inmouseblastocysts［J］.JReprod Dev，2003，49（6）：413-423.

［33］Marcos J，Pérez-AlbaláS，Mifsud A，etal.Collapseofblastocysts is strongly related to lower implantation success:a time-lapse study ［J］.Hum Reprod，2015，30（11）：2501-2508.

［34］Bodri D，Sugimoto T，Yao Serna J，et al.Blastocyst collapse is not an independentpredictor of reduced live birth:a time-lapse study ［J］.FertilSteril.2016，105（6）：1476-1483.

［35］Basile N，Meseguer M.Time-lapse technology:Evaluation of embryo quality and new markers for embryo selection［J］.Expert Review ObstetGynecol，2014，7（2）：175-190.

［36］Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special InterestGroup of Embryology.The Istanbul consensusworkshop on embryo assessment:proceedings of an expert meeting［J］.Hum Reprod，2011，26（6）：1270-1283.

［本文编辑秦娟］

Screening High Quality Blastocyst by M orphological and K inetic Parameters

WEIMing-ming，HE Yu-jie. Clinical Medicine College of ShanxiMedical University，Taiyuan 030001，China（WEIMing-ming）；First Hospital of ShanxiMedical University，Tiayuan 030001，China（HE Yu-jie）

HE Yu-jie，E-mail：hyj7007@163.com

（2016-03-23）