2010-2015年扬州地区淋球菌耐药性和流行株质粒谱的研究

时祝帅,王德霞,聂青松

·检验医学·

2010-2015年扬州地区淋球菌耐药性和流行株质粒谱的研究

时祝帅,王德霞,聂青松

目的：检测扬州地区临床分离淋球菌的耐药性和质粒谱，为临床合理用药和质粒介导的耐药性动态改变提供参考。方法：2010-2015年临床分离191株淋球菌，采用纸片酸度法检测产β-内酰胺酶菌株(PPNG)。采用WHO推荐琼脂稀释法测定菌株对5种抗生素(头孢曲松、壮观霉素、环丙沙星、青霉素、四环素)的药物敏感性。用碱裂解法分析菌株的质粒谱。结果：191株对壮观霉素全部敏感；108株对头孢曲松敏感，占56.54%，中度敏感83株，占43.46%，无耐药；环丙沙星、四环素、青霉素耐药菌株分别为187株(97.90%)、163株(85.34%)、162株(84.82%)，PPNG 81株(42.41%)，质粒介导的四环素高度耐药株(TRNG)98株(51.31%)。146株(76.44%)检出质粒，7种质粒谱型。结论：壮观霉素可作为扬州地区淋病治疗首选用药，其次为头孢曲松，使用头孢曲松应随时观察其疗效。扬州地区淋球菌耐药性以质粒介导耐药为主，TRNG阳性率发生显著变化，建立当地淋球菌耐药流行簇的分子生物学档案，可为菌株的溯源提供流行病学依据。

耐药性；质粒谱；淋球菌

由于抗生素的不规则应用，淋球菌耐药性不断发生变化，并逐年增加，加重了临床治疗难度。淋球菌产生的耐药机制与以质粒介导的耐药以及染色体基因突变等有关，不同地区、不同时期淋球菌质粒谱各有特点[1-3]，了解其变化有助于区别流行株，从分子水平上为菌株流行病学研究提供客观可靠的信息。扬州地区自2010年起连续6年检测临床分离的淋球菌191株，研究本地区淋球菌对抗生素的敏感性和质粒介导耐药率及其变迁特点，根据细菌耐药情况及耐药原因针对性指导临床合理用药，减少耐药菌株流行，同时结合质粒谱分析对淋病患者进行传染源的追踪。现将结果作一报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 从2010-2015年扬州市皮肤病

性病防治所性病门诊患者泌尿生殖道分泌物分离培养获得191株淋球菌，所有菌株经革兰染色、氧化酶、糖发酵试验初步鉴定后传代1次，洗于脱脂牛奶中，-70 ℃冰箱保存备用。标准菌株由中国药品生物制品鉴定所提供。

1.1.2 主要试剂 抗生素头孢曲松、壮观霉素、环丙沙星、青霉素、四环素标准粉剂由中国医学科学院皮肤病研究所提供；GC琼脂为英国Oxiod公司生产；质粒提取试剂盒E．Z．N．A．TMPlasmid Mini Kit I为OMEGA公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 最小抑菌浓度(MIC)测定 采用琼脂稀释法测定临床分离淋球菌对头孢曲松、壮观霉素、环丙沙星、青霉素、四环素等5种抗生素的MIC[4]。每批实验以标准菌株作为质控菌株。药物敏感性判断标准：头孢曲松MIC≤0.03 μg/mL为敏感(S)，0.06～0.5 μg/mL为中度敏感(D)，≥1 μg/mL为耐药(R)；壮观霉素MIC≤64 μg/mL为敏感，≥128 μg/mL为耐药；青霉素和环丙沙星MIC≤0.03 μg/mL为敏感，0.06～0.5 μg/mL为中度敏感，≥1 μg/mL为耐药；四环素≤0.5 μg/mL为敏感，≥1 μg/mL为耐药，根据WHO判定标准[5]，四环素MIC≥16 mg/L判为质粒介导的四环素高度耐药株(TRNG)阳性。

1.2.2 产β-内酰胺酶菌株(PPNG)测定 采用纸片酸度定量法[6]测定PPNG，并用已知的β-内酰胺酶阳性(E株)和阴性(A株)标准株作对照。

1.2.3 质粒提取及质粒谱分析 PPNG、TRNG株质粒检测按照文献[7]，用碱裂解法抽提质粒，在用TBE缓冲液配制0．8%琼脂糖凝胶平板上，5 V/cm电压，电泳3～4 h。溴乙啶染色，用英国UvI凝胶成像系统分析，根据标准Marder的电泳结果为标准系统，以其相对迁移率为自变量，分子量对数值为因变量建立回归方程，然后以待测质粒条带的迁移来计算其相对分子质量大小。

2 结果

2.1 淋球菌对5种抗生素的敏感性 191株临床分离的淋球菌对壮观霉素全部敏感，92株对头孢曲松中度敏感(48.17%)；对环丙沙星、四环素、青霉素耐药分别为187株(97.90%)、163株(85.34%)、162株(84.82%)；PPNG 81株(42.41%)，TRNG 98株(51.31%)。2010-2015年扬州地区淋球菌对5种抗生素敏感性的检查结果见表1。

表1 2010-2015年扬州地区淋球菌对5种抗生素敏感性的检查结果[菌株数(%)]

年度菌株数四环素 S R PPNG 阴性 阳性 TRNG 阴性 阳性 2010338(24.24)25(75.76)20(60.60)13(39.40)21(63.64)12(36.36)2011358(22.86)27(77.14)21(60.60)14(40.00)20(57.14)15(42.86)2012294(13.29)25(86.21)16(55.17)13(44.83)14(48.28)15(51.72)2013314(12.90)27(87.10)18(58.06)13(41.94)13(41.94)18(58.06)2014303(10.00)27(90.00)17(56.67)13(43.33)12(40.00)18(60.00)2015331(3.03)32(96.97)18(54.55)15(45.45)13(39.39)20(60.61)合计191 28(14.66)163(85.34)110(57.59)81(42.41)93(48.69)98(51.31)

2.2 质粒检测 191株淋球菌中146株(76.44%)检出质粒，7种质粒谱型。PPNG 有5种质粒谱，以4.2 kb+7.4 kb 36株(24.66%)为主；TRNG有5种质粒谱，以4.2 kb+39.5 kb+42.5 kb 43株(29.45%)为主。扬州地区146株淋球菌质粒分布情况见表2。

3 讨论

本研究从2010年连续6年对扬州地区临床分离的191株淋球菌进行5种抗生素的耐药检测，结果显示：(1)壮观霉素6年未发现耐药菌株，广州、南京和南昌有少数耐壮观霉素药物的菌株报道[1-3]，说明该抗生素在扬州地区对临床分离的淋球菌活性最强，具有良好的临床疗效，可以作为扬州地区初次治疗淋病的首选药物，也可作为头孢菌素过敏患者治疗淋病的选择药物[8]。191株淋球菌对头孢曲松中度敏感率(43.46%)显著高于广州和南京的报道[9-10]，且中度敏感菌株从2010年的24.24%逐年增至2015年的51.52%。这一现象提示扬州地区淋球菌对头孢曲松可能耐药不断上升，因此临床上使用头孢曲松应随时观察其疗效，避免不规则用药。(2)由于喹诺酮类抗生素的大量使用，使淋球菌对环丙沙星的耐药性出现广泛的播散和流行，造成同一地区淋球菌对环丙沙星的耐药率大幅度上升。扬州地区对环丙沙星的耐药率为97．90%，与江苏地区淋球菌对环丙沙星耐药率99.36%接近[9]，2012-2015年没有发现对环丙沙星敏感的菌株，因此，目前环丙沙星不宜再作为扬州地区治疗淋病的推荐药物。(3)扬州地区淋球菌对青霉素的耐药率从2010年的69.70%上升到2015年的93.94%，四环素的耐药率从2010年的75.76%上升到2015年的96.97%，表明该两种药物也不宜再作为治疗淋病的选择药物。(4)PPNG和TRNG 是淋球菌中最主要流行的耐药菌株。本研究结果显示，2015年PPNG阳性率45.45%与2010年阳性率39.40%以及本地区2004-2007年阳性率41.10%[11]均较接近；2015年TRNG阳性率60.61%与2010年阳性率36.36%及本地区2004-2007年阳性率27.40%[11]比较上升较快，PPNG/TRNG阳性率与佛山相关报道[12]一致，明显高于国内外报道[1，13]，PPNG/TRNG不同地域的不同检出率，是否与该地区临床有效的诊断、有效的抗菌药物治疗及性活动、性行为的变化有关系，提示对青霉素、四环素、PPNG/TRNG进行淋球菌耐药追踪监测有重大意义。

表2 2010-2015年扬州地区146株淋球菌质粒分布情况

对扬州地区2010-2015年临床分离146株淋球菌进行质粒分型，结果显示，含7.4 kb的“亚洲型”69株(47.26%)；PPNG首次检出10株(12.34%)5.3 kb“非洲型”，与上海、佛山等报道[12,14]结果相近，提示扬州地区PPNG流行株主要携带亚洲型β-内酰胺酶基因；42.5 kb质粒携带TetM基因，介导淋球菌髙水平耐四环素，结果显示含42.5 kb 94株(64.38%)，与国内报道[3,9,12]存在较大差异，表明TRNG携带质粒分布存在明显的地区差异。临床分离的191株淋球菌共有7种质粒谱，其中以4.2 kb+7.4 kb和4.2 kb+39.5 kb+42.5 kb为主，共79株(54.11%)，与王德霞等[11]报道不同，表明该地区PPNG/TRNG高耐药基因的质粒分布已发生变化；检出7.4+39.5+42.5、4.2+7.4+39.5+42.5 kb共33株(22.60%)，提示PPNG/TRNG质粒谱型与淋球菌多重耐药有一定关系。淋球菌质粒谱作为淋球菌流行病学监测的工具，其敏感性还不够，所以在扬州区域内，充分利用分子分型技术建立具有某一特性的菌株型别数据库，从而建立起当地淋球菌流行簇的分子生物学档案[14]，可为淋球菌耐药菌株的溯源提供流行病学依据。

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(本文编辑 刘璐)

2016-07-06

江苏省扬州市疾病预防控制中心 皮肤病性病防治所，225002

时祝帅(1975-)，男，主管技师.

1000-2200(2016)12-1681-03

R 378.16

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.046