小鼠脊髓损伤中的长链非编码RNA表达谱

丁 亚，刘锦波

·基础医学·

小鼠脊髓损伤中的长链非编码RNA表达谱

丁 亚，刘锦波

目的：研究脊髓损伤中的差异性长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)表达谱。方法：应用MASCIS脊髓撞机仪制造小鼠脊髓损伤模型，按照损伤后取脊髓时间再分成1 d、3 d、7 d和21 d组及正常对照组，分别提取总RNA，进行芯片分子杂交，构建脊髓损伤后差异性LncRNA表达谱，挑选神经组织特异性LncRNA通过荧光定量PCR实验验证芯片结果可靠性，对差异性表达LncRNA所参与的信号通路进行分析。结果：脊髓损伤后LncRNA出现差异性表达，损伤后7 d出现了差异性表达最大值，荧光定量PCR实验验证芯片结果可靠，差异性LncRNA涉及较多信号通路。结论：LncRNA在脊髓损伤中病理过程中发生了差异性表达。

脊髓损伤；长链非编码RNA；信号通路；小鼠

神经损伤难以恢复，尤其是脊髓损伤更是世界性难题，往往造成患者终生残疾及经济负担，引起很多社会心理问题[1]。脊髓损伤是一个复杂的病理过程，涉及到许多细胞及分子变化[2]。因此，寻找有效治疗脊髓损伤的方法必须明确脊髓损伤病理过程。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度>200 nt，缺乏显著开放阅读框的非编码RNA。其曾被认为是分子噪音，近年来越来越多的研究发现LncRNA与神经发育密切相关[3]，参与神经系统的生长发育和功能完善[4]。作为非编码RNA的重要组成部分，LncRNA参与了神经元分化、脑发育及突触可塑性[5]。LncRNA通过调控编码基的表达，使神经系统按照一定的时间和空间顺序进行生长和发育[6]。LncRNA在胚胎时期就参与了胚胎细胞定向分化成神经细胞过程[7]。因此，探索脊髓损伤过程中LncRNA的表达变化有助于我们进一步认识脊髓损伤病理过程。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及动物模型[8-9]雌性ICR小鼠(苏州大学实验动物中心提供)15只，体质量为20～25 g，分成5组(3只/组)：正常对照组；SCI组，按照损伤后取脊髓的时间再分成1 d、3 d、7 d和21 d组。SCI组动物用0.35%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，深度麻醉后，俯卧位，取正中最高点为中心，备皮后，消毒常规铺巾，行背部正中切口，分离椎旁肌，显露T11～L1棘突及椎板，咬去棘突及椎板后，充分显露脊髓背侧，利用MASCIS脊髓撞机仪制造小鼠脊髓损伤模型。小鼠随后出现下肢对称性抽搐，出现下肢瘫痪。逐层缝合肌肉筋膜及皮肤。SCI组动物术后表现双下肢瘫痪及膀胱膨胀，予以早晚膀胱按摩人工排尿各1次。正常对照组不作处理。所有实验动物均予相同饮食及光照，存活良好。

1.2 RNA的提取及芯片杂交 分别处死实验动物后取以损伤点为中心头端及尾端各5 mm的脊髓组织，按照Invitrogen公司说明书步骤，利用Trizol(Invitrogen，美国)提取组织总RNA。利用微量分光光度计测量总RNA浓度，每组内个体(3只)总RNA等质量混合为芯片杂交准备。利用Affaystar Mouse LncRNA Expression Micraoarray芯片(Arraystar，美国)进行RNA杂交，利用GeneChip Scanner 3000 7G型扫描仪扫描芯片的荧光信号强度，得到原始微点阵图片，并将图片输入Affymetrix GeneChip Operating Software以进行数据分析，采用Affymetri Expression Console进行数据解析。

1.3 荧光定量PCR验证实验 挑选8个神经系统特异性LncRNA进行实时定量荧光逆转录多聚酶链反应(qRT-PCR)验证，分别以来自5组小鼠脊髓提取的总 RNA逆转录cDNA为模板，采用ABI 7500型荧光定量 PCR仪，SYBR Green荧光染料(TaRaKa公司，美国)为PCR反应原料，利用Prime 5及DNA man 软件设计定量PCR所需引物，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，按照以下程序进行PCR反应：(1) 95 °C 5 min；(2)95 °C 15 s，60 °C 40 s和 72 °C 20 s，共40个循环。最后以GAPDH为内参，2-ΔΔCT方法计算相对差异表达的倍数。

表1 定量PCR引物

1.4 差异性基因信号通路分析 京都基因与基因组(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是系统分析基因及其编码产物间关系、基因功能和基因信息的数据库[10]，把目标基因参与的信号通路进行分析，得到具有显著性富集的信号通路。

1.5 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 小鼠差异性表达LncRNA 与0 d比较，变化倍数超过2倍视为差异性基因。本研究发现，脊髓损伤后1 d差异性基因的数目并未有明显增加，损伤后3 d，差异性基因数目有较明显的增加，损伤后7 d，差异性基因数目出现了明显增加，损伤后21 d，差异性基因数目较第7天明显减少回落(见表2)。差异性基因随时间变化出现的差异性表达见图1。

表2 差异性表达LncRNA数目变化

2.2 荧光定量PCR验证实验 对8个神经系统特异性LncRNA(NONMMUT052085；NONMMUT038925；NONMMUT06711；NONMMUT051225；NONMMUT005924；NONMMUT070015；NONMMUT021928和NONMMUT061607)进行定量PCR反应，差异均有统计学意义(P<0.01)(见表3)，定量PCR实验验证芯片结果较可靠。

2.3 差异性基因信号通路分析 利用KEGG数据库，我们发现差异性基因涉及神经配体受体信号通路、PI3K-AKT信号通路、黏附斑激酶信号通路、生化代谢信号通路、破骨细胞分化因子信号通路及溶酶体信号通路等(见图2)。

3 讨论

脊髓损伤是一个复杂的病理过程，涉及到大量的细胞及分子变化，近年来，许多研究发现LncRNA富集在小鼠中枢神经，且影响着神经的发育，并且与许多神经系统疾病密切相关。LncRNA可以在不同层面调节编码基因表达，机制复杂[11]。因此，研究脊髓损伤中LncRNA的差异性表达，有助于我们进一步明确脊髓损伤病理过程。

脊髓损伤动物模型是研究脊髓损伤的主要工具。损伤的可重复性是脊髓损伤动物模型是否可靠的重要特征，研究表明，MASCIS碰撞仪可以产生脊髓损伤经典模型[12]。早前研究发现，脊髓在受到原发性损伤主要是机械力对脊髓的直接损伤，导致了神经细胞的死亡及大量丢失。随之而来的是继发性损伤，主要是微血管再灌注损伤、氧自由基产生、脂质过氧化及离子紊乱，易导致神经细胞凋亡[13]。本研究表明在脊髓损伤7 d后，细胞和分子改变达到最高峰。通过对不同时间点损伤小鼠脊髓提取总RNA和正常小鼠脊髓提取总RNA，分别予以Affaystar Mouse LncRNA Expression Micraoarray 芯片进行杂交，通过荧光值反映表达量的方法进行比较得出差异性表达LncRNA，通过对不同时间点差异性表达LncRNA数目分析，在损伤后7 d，LncRNA差异性表达达到最大。提示LncRNA在脊髓损伤后7 d发挥作用达到顶峰。通过对差异性基因所在信号通路分析，有助于把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。其中富集值越大，代表差异性基因涉及该信号通路越密切。对差异性基因信号通路分析可以发现涉及通路较多，神经配体受体信号通路是神经系统行使功能所涉及的重要通路，该通路包含了许多离子交换及神经递质释放等，表明LncRNA参与神经功能的行使，LncRNA与许多神经系统疾病密切相关一致。通过KEGG数据库可以发现，PI3K-AKT信号通路有许多功能，其主要涉及到细胞生长、发育及凋亡相关。研究表明脊髓损伤后PI3K-AKT信号通路激活有助于神经轴突生长[14]。LncRNA参与该信号通路进而参与脊髓损伤后神经修复是下一步研究重点。

表3 定量PCR验证芯片结果可靠性比较

NONMMUT005924GAPDH△CTNONMMUT070015GAPDH△CT NONMMUT021928GAPDH△CT NONMMUT061607GAPDH△CT 对照组25.14±1.5221.48±1.093.66±0.43 26.78±1.6722.54±1.264.24±0.41 24.69±0.9221.49±1.643.20±0.72 26.15±1.0522.16±1.343.99±0.29 1d27.18±1.4122.46±1.674.72±0.26**27.48±0.9121.49±0.835.99±0.08**26.88±1.6622.56±1.574.32±0.09**28.08±0.9422.46±0.875.62±0.07**3d27.85±1.5722.69±1.055.16±0.52**27.57±1.8422.15±1.095.42±0.75**27.29±1.0722.67±1.194.62±0.12**29.78±1.1221.68±1.088.10±0.04**7d27.78±1.0822.49±0.915.29±0.17**27.17±0.9221.58±1.165.58±0.24**27.45±0.9723.15±0.914.30±0.06**29.94±1.0822.49±0.937.45±0.15**21d26.68±1.0622.57±0.934.11±0.13 27.88±1.0522.16±1.175.72±0.12**26.78±1.5722.16±1.494.62±0.08**27.49±1.0721.49±0.826.00±0.25**F12.71 8.48 9.372.69P<0.01 <0.01 <0.01<0.01MS组内 0.114 0.162 0.1100.035

综上所述，在小鼠脊髓损伤模型中LncRNA出现差异性表达，表明LncRNA参与脊髓损伤病理过程，通过对差异性基因所涉及的信号通路改变，我们推测LncRNA参与了脊髓损伤后神经系统功能紊乱及神经细胞生长凋亡，具体机制仍需进一步研究。

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(本文编辑 刘璐)

Expression profile of LncRNA in spinal cord injury mice

DING Ya,LIU Jin-bo

(DepartmentofOrthopedics,TheThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,ChangzhouJiangsu213000,China)

Objective:To investigate the expression profiles of differential long non-coding RNA(LncRNA) in spinal cord injury mice.Methods:The spinal cord injury mice model were established using MASCIS Impactor weight-drop device,and divided into the 1 d,3 d,7 d and 21 d groups according to the time of harvesting the injured spinal cord.The total RNA was extracted from the injured spine cord,which was used to RNA hybridization using microarray for constructing the different expression profile.The specific LncRNA of nerve tissue was validated by quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR) to verify the reliability of the microarray.The signal pathway involved in the differential LncRNA was analyzed.Results:The differential expression of LncRNA was identified after the spinal cord injury,the expression of which arrived at the highest after 7 days of injury.The result of qRT-PCR showed that the reliability of microarray was good,and the differential LncRNA was involved in sevel signaling pathways.Conclusions:The LncRNA expression in the pathologic process is different after the spinal cord injury

spinal cord injury;long non-coding RNA;signal pathway;mouse

2016-02-18

国家自然科学基金资助项目(81471263)；江苏省自然科学基金资助项目(BK20151177)

苏州大学附属第三医院 骨科，江苏 常州 213000

丁 亚(1991-)，男，硕士研究生.

刘锦波，博士研究生导师，教授.E-mail：czljbljb@126.com

1000-2200(2016)12-1541-04

R 651.2

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.001