agrC对表皮葡萄球菌生物膜形成作用机制的研究进展

成鹏 叶联华

650118昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）胸外一科

agrC对表皮葡萄球菌生物膜形成作用机制的研究进展

成鹏 叶联华

650118昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）胸外一科

表皮葡萄球菌在医用生物材料表面形成的生物膜可有效抵御抗生素的治疗，导致感染迁延不愈，已成为近年来的研究热点。影响生物膜形成的众多基因构成了复杂的调控网络，在生物膜形成的不同阶段发挥不同的作用，其中表皮葡萄球菌附属基因调节子（agr）系统是调节生物膜形成的最重要基因之一。就细菌生物膜的形成过程、agr系统及其相关基因对生物膜形成调控机制的研究现状进行综述，为研究以agr为靶点治疗表皮葡萄球菌生物膜引发的相关感染提供参考。

表皮葡萄球菌； 细菌生物膜； agr； 基因调控机制

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81260228,81460278);Natural Science Foundation of Yunnan Province(2013FZ276,2014FA048);Yunnan Provincial High-level Personnel Training Fund (2012HB032,D-201222)

0 引 言

随着生物材料在临床上的广泛应用，生物膜引发的相关感染因易耐药、易播散、易复发等特点受到越来越广泛的关注[1-2]。表皮葡萄球菌是定居于人体皮肤和黏膜表面最常见的正常菌群。作为凝固酶阴性葡萄球菌，表皮葡萄球菌仅产生有限的蛋白酶及胞外毒素，但近年来其在生物材料植入物中已有较高的分离率[3]。研究表明，表皮葡萄球菌以静脉导管、乳腺假体、气管插管、人工关节等植入物为载体，通过细菌定植、细菌间黏附、分泌胞外基质等途径形成结构复杂的生物膜；表皮葡萄球菌的生物膜一旦形成，可有效适应机体微环境，并抵御抗生素的浸透，引起难治性细菌生物膜相关感染，并导致感染迁延不愈，甚至危及生命[1-4]。文献报道，对植入材料进行表面涂层改性可抑制细菌生物膜的形成，降低临床感染率，并能增加抗生素治疗的敏感性[5-7]。

近年来，关于表皮葡萄球菌生物膜形成的研究发展迅速，本文就生物膜的形成过程及生物膜形成的相关调控基因进行综述。

1 生物膜的形成

细菌生物膜的形成可分为4个阶段：起始黏附、细菌间的吸附与增殖、生物被膜成熟及成熟生物膜细菌脱落[8-9]。细菌在暴露于生物材料表面的1～2 h内即进入起始黏附阶段，生物材料植入物表面有多种蛋白质组件的表达，增加了细菌在其表面的黏附力。细菌通过疏水作用和特异性的表面结构如自溶素相关基因（atlE/aae）等贴覆到生物材料表面形成直接黏附，或通过细胞壁表面的黏附因子SdrG、纤维蛋白原结合蛋白（fibrinogen-binding protein，Fbp）、细胞外基质结合蛋白（extracellular matrix binding protein，Embp）等与血清蛋白相互作用间接黏附于生物材料表面，形成初始附着[9-11]。

其后是一个过渡态，即“中间生物膜状态”，细菌间形成一个个小的细菌群落或称“微克隆”。有学者将生物膜形成过程中由50个以上的细菌相互黏连的结构定义为“微克隆”，以此作为生物膜的组成单位。在多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）、Embp、聚集相关蛋白（accumulationassociated protein，Aap）、生物膜相关蛋白（biofilmassociated protein，Bap）及其同源蛋白Bhp、磷壁酸（teichoic acids，TA）和胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）等多种细菌表面物质的参与下，开始细菌增殖过程。此阶段通常起始于细菌暴露后6 h左右，黏附于生物材料表面的细菌通过分裂、聚集增加生物膜厚度，并分泌细胞外基质将细菌包裹在内，同时形成通道与空隙供细菌进行物质代谢与信息交流，细菌生物膜初步形成[9-14]。

关于如何界定成熟生物膜的建立尚无统一共识，有学者以抵御抗生素的能力来衡量，亦有根据生物膜厚度来衡量。随着微克隆群体的增多，通过PIA、Aap、Bap/Bhp等的介导，细菌群落相互聚集，生物膜的厚度逐渐增加。其中，Aap可通过自身结构域的构象变化产生同源二聚化，促进细菌间的相互聚集；PIA是促进生物膜形成的主要成分之一，其主要依赖胞间黏附素（intercelluar adhesion,ica）操纵子icaADBC编码的产物IcaA合成，该产物具有N-乙酰葡萄糖基转移酶（N-acetylglucosamine transferase）活性。体外实验中，24 h即可产生厚度较为稳定的成熟生物膜[12-15]。

成熟生物膜由多层细胞组成，细胞层中有许多细胞团块形成的中央较为密集、外周相对稀疏的结构。细胞团块间有基质，并被网状管道所分隔。中央区代谢产物相对较多，而通过管道系统得到的营养较少，相对缺氧的局部环境势必对内层细菌的生长产生一定的影响。生长在不同层次的细菌因对氧利用的差异性使得代谢方式也发生相应变化，如在缺氧环境下，内层的细菌可通过下调DNA复制、减少蛋白表达等方式适应周围环境。成熟的生物膜还可通过表型转化PIA阴性形成边缘规整、结构紧致的生物膜来增强适应性[13-16]。

成熟的细菌生物膜达到一定程度后，由于细菌代谢及营养物质的消耗部分细胞会出现脱落，通过血流转移到其他部位，造成感染的扩散。细菌通过产生蛋白酶以降解生物膜表面的多聚物，并产生小分子肽酚可溶性调控蛋白（phenol-soluble modulins, PSMs）促进细胞的脱离和播散。体外实验中，48 h即可见部分生物膜开始固缩、崩解[8-10]。

以上4个阶段并非相互独立、界限分明，而是在整个过程中彼此重叠，成熟生物膜部分细菌脱落后在其他器官再次定植，重复上述过程，又形成新的细菌生物膜。

2 表皮葡萄球菌附属基因调节子的调控

附属基因调节子（accessorygeneregulator,agr）是双组分信号传导系统（two-component signal transduction systems,TCSs）的一员。TCSs包含组氨酸激酶（histidine kinase,HK）域和反应调节蛋白（response regulator,RR）结合域两部分，其中 HK含有HATPase_c和HisKA两个功能域。外界信号分子首先作用于HK的膜外配体结合区，激活激酶的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）结合部位，而HATPase_c功能域具有ATP酶活性，可水解ATP提供能量，并转移磷酸基团至激酶HisKA功能域的组氨酸位点，使其发生自身磷酸化。随后，RR调控区域与磷酸化的HK相互作用，磷酸基团又再次转移至自身天冬氨酸位点上，发生自身磷酸化，并激活效应区，引起构像改变，使得DNA结合位点暴露，从而结合不同DNA序列产生一系列调控反应[17-18]。

agr系统由约3.5 kb的一段序列编码，该序列包含RNAⅡ和RNAⅢ两个相对独立的转录单位，分别由启动子P2和P3启动。P2启动RNAⅡ转录，RNAⅡ包括agrA、agrB、agrC和agrD 4个开放阅读框。其中agrA含238个氨基酸残基，是表皮葡萄球菌二元系统中的反应调节因子，编码RR；agrB由4个疏水的跨膜区和2个富含正电荷氨基酸残基的亲水性跨膜区组成，具有蛋白酶活性；agrC含429个氨基酸残基，具有6或7次跨膜区段和1个HK结构域，是表皮葡萄球菌二元系统中的信号转导因子[19-20]；agrD是agr系统自诱导肽（autoinducing peptide,AIP）的前体物质，其经agrB特异性识别后，再经2个蛋白酶裂解和1个硫内酯形成的过程加工为成熟的自诱导信号分子AIP，并被运输至胞外。AIP大多含5～17个氨基酸残基，序列中的半胱氨酸和C末端氨基酸之间形成硫酯键，成为一个包含硫解内酯的环状结构[21]。当菌落密度较低时，AIP浓度也较低；当菌体到达一定的密度，胞外释放的AIP积累达到阈值浓度，便能与跨膜蛋白agrC的疏水基相作用，从而激活agrC蛋白激酶胞内域部分的活性，通过磷酸基转移形成磷酸化agrA，后者可与位于P2、P3基因间隔区的转录调节蛋白葡萄球菌辅助调节子A（Staphylococcal accessory regulator A,SarA）结合，激活P2、P3启动子从而形成一个RNAⅡ的反馈循环和RNAⅢ的转录。因此，agrC和agrA构成了表皮葡萄球菌毒力信号的二元组分调节[20-24]。RNAⅢ包含514个核苷，其中含有1个小的开放读码框，具有14个发卡结构和3个螺旋结构。RNAⅢ可分为5'端结构域（1～31 nt）、中央结构域（32～382 nt）和3'端结构域（383～514 nt）。5'端的环状结构能帮助维持RNAⅢ的稳定性并具有正向调控δ-溶血素翻译的作用；中央结构域通过构象变化帮助受体蛋白结合；3'端结构域可调控多种蛋白的分泌表达，已发现其可抑制蛋白A的合成。RNAⅢ是hld基因的调节RNA和信使RNA，能编码δ-毒素等，并能调控多种胞外蛋白及菌体表面蛋白的表达，如肠毒素、溶血素等多种毒素的分泌[24-25]。RNAⅢ的转录是通过agrA或SarA结合到P3启动子上而被诱导的[20-24]。

AIP通过被HK受体agrC识别来实现对表皮葡萄球菌毒力的调节。一些AIP可促进毒力基因的表达，而另一些却有抑制作用。不同种属的葡萄球菌分泌的AIP对agr系统存在交叉抑制现象，由一种葡萄球菌生成的AIP能抑制另一种葡萄球菌agr调节系统的表达[24-25]。目前仍未能明确AIP是如何调节agrC作用的，有研究表明，agrC功能的发挥需要一个富含阴离子脂质的膜。HK受体agrC的激活或抑制是通过构象变化实现的，agrC激酶域和感应结构域由一个具有螺旋构象的结构相连接，该结构以类似变阻器的作用控制激酶活性。激动剂和拮抗剂在此螺旋结构上以相反的方向旋转，产生不同的效应[24-27]。体外研究表明，agr基因可通过下调atlE、酪蛋白裂解酶P（caseinolytic protease P,clpP）的表达抑制生物膜的形成，并通过调节D-丙氨酸：D-丙氨酸连接酶（D-alanine:D-alanine ligase）来影响细菌细胞壁的合成。在生物膜成熟后，agrC又可促进PSMs的产生使细菌从成熟的生物被膜中分离开来，发生远处播散，引起其他器官的感染或导致感染迁延不愈[27-28]。

3 对agr系统有调控功能的基因

在对金黄色葡萄球菌的研究中发现，RNAⅢ激活蛋白的靶蛋白（target of RNAⅢ-activating protein, TRAP）是活化agr系统的一个重要通路蛋白。TRAP是葡萄球菌生物膜形成相关蛋白，包含167个氨基酸残基，是一段高度保守的序列。磷酸化的TRAP可被RNAⅢ激活蛋白（RNAⅢ-activiating protein, RAP）识别，调节RNAⅢ的转录并分泌毒素。RAP是葡萄球菌分泌到细胞外的33 ku的自诱导因子，通过调节TRAP的3个保守组氨酸残基的磷酸化从而激活agrC系统。TRAP蛋白与RAP蛋白的结合位点可能在TRAP蛋白氨基酸序列的Ser-75和Thr-76。当trap基因插入失活突变或磷酸化被抑制时，细菌不能形成生物膜，亦不能产生毒素，丧失了致病性，且相应毒力因子及其调节子的转录也有所下降。TRAP蛋白还可通过自身修复避免DNA的氧化损伤，利用细菌双杂交系统研究蛋白间相互作用发现，OpuCA是TRAP的结合蛋白[28-29]。对trap基因和RNAⅢ转录水平的检测结果表明，RNAⅢ的转录水平随细菌生长变化而增加，而trap基因的转录水平则保持不变，提示trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性，TRAP蛋白可能不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物[30-31]。

SarA是一种全局转录调节蛋白，控制细胞中许多与毒性相关的基因表达，能直接调节多种毒力因子的产生[32]。SarA由124个氨基酸残基组成，以形成二聚体的方式与靶点相结合，通过以下机制调节转录过程：改变靶基因构象，帮助调节蛋白接触；多个SarA二聚体间构成DNA的封闭状态，不利于转录的发生；形成异源二聚体，干扰同源二聚体的功能；同源蛋白的竞争性替代。SarA可通过激活agr调控系统中P2和P3启动子区域，增加RNAⅢ的转录水平而发挥效应，也可独立于agr系统发挥作用。SarA与其上游一段富含AT的序列相结合从而在转录水平直接调控atlE、ica、脂肪酶基因（lipA）、膜相关锌金属蛋白酶基因（zinC）等基因的表达；或结合到agr、SarS、毒素阻抑基因（Rot）、纤粘连结合蛋白（FnBP）、葡萄球菌蛋白A（Spa）、Bap和IcaRA等调节基因和目标基因上影响其转录。SarA对atlE的表达起负调控作用，而对ica、lipA和zinC的表达则起正调控作用。SarA的表达可促进细菌生物膜的形成，SarA突变不仅能限制细菌生物膜的形成，还能在体内外增加抗生素的敏感性。SarA突变能使胞外核酸酶（extracellular nuclease）表达上调，但对剥脱毒素A（exfoliativetoxin A，ETA）和剥脱毒素B（ETB）的表达却有下调作用。通过SarA直接或间接控制表达的基因多达120余个[32-33]。

4 生物膜形成相关的其他基因

ica是编码PIA的基因，该基因组中包括主要编码细胞膜上尿苷二磷酸（UDP）-N-乙酰葡糖胺转移酶的icaA和icaD、形成细胞表面蛋白并运输至胞外的icaC及编码脱乙酰酶的icaB。icaDCBA在细菌生物膜的形成过程中起了重要作用，调节PIA相关的细菌黏附、增殖以及免疫逃逸；介导对中性粒细胞杀伤作用的逃逸，提高表皮葡萄球菌的耐药性[34]。同时icaDCBA也受多方面的调节，SarA、SarZ、arlR/S等因子可以icaDCBA作为下游功能基因，通过直接调节icaDCBA的转录对生物膜的形成起正调控作用。icaR位于ica操纵子上游，可编码对icaDCBA有负调控作用的IcaR蛋白。SarX可通过下调IcaR蛋白的表达间接激活icaDCBA从而促进表皮葡萄球菌生物膜的形成。icaA基因单独表达仅能诱导N-乙酰葡糖胺转移酶的低水平表达，而icaA与icaD基因的协同表达则可大大增强酶的活性，促进细菌生物膜的形成[34-36]。

eDNA是一种独立于细胞外的DNA，广泛存在于体液中。细菌生物膜可通过菌膜中菌体的裂解、释放含有DNA的小囊泡和活细胞主动分泌等方式向胞外输送DNA。eDNA能在细菌生物膜形成的起始黏附阶段促进菌体间的黏附，在细菌培养液中加入DNA酶破坏eDNA，细菌的黏附显著减少，而加入RNA酶并无类似作用。eDNA在生物膜形成后继续维持其结构的稳定性，促进单个菌体连接至细菌群落，并阻止细菌从菌落上被冲刷下来。生物膜基质中的eDNA可被周围活菌利用菌体表面非特异性的DNA结合受体摄入胞内，其中一条链被核酸酶降解，另一条链通过DNA异位复合体进入胞质。eDNA还可通过RecA介导的同源重组过程插入受体菌染色体DNA中，若摄取的eDNA与受体菌有同源性区域，eDNA便可整合入受体菌的染色体中；若摄取的eDNA为异源性，则可作为碳基与能量的来源，为生物膜形成提供营养[37-38]。eDNA受多个基因的调节，cid编码一种能在细胞表面打孔的物质，lrg则编码一种具有抗打孔作用的物质，两者相互平衡，调节胞壁质水解酶的活性，控制细菌的程序性死亡和溶解。cid高表达，lrg低表达则促进细胞死亡、溶解，释放eDNA。体外研究表明，cid/lrg维持在一定水平的平衡有利于细菌生物膜的形成。Alt操纵子可通过编码合成胞壁质水解酶，降解菌体细胞壁，促进细胞自溶释放eDNA。此外，SAERs双组分调节系统也通过影响DNA的释放和Aap表达调节生物膜的形成过程[37，39]。

此外，细菌生物膜的形成还受arlR/S双组分信号转导系统调节。arlS基因可调控细菌生物被膜的形成、菌细胞自溶以及胞外细菌裂解酶的活性，也可通过降低RNAⅡ转录，在一定程度上降低RNAⅢ的转录。arlR/S可能主要依赖对icaDCBA基因的调控实现对表皮葡萄球菌生物膜的作用，这一点与金黄色葡萄球菌不同。凝胶迁移实验结果证实，arlR可以结合到ica的启动子区域[40]。

5 问题与展望

agr系统是近年来的研究热点，agr系统激活后可通过抑制起始黏附、细菌增殖并促进细菌脱离的机制减少生物膜的形成。这样的结果一方面增强了抗生素的治疗效果，另一方面可能导致感染的远处播散。通过特异性结合的多肽类物质抑制agr群体感应系统的激活可有效减少毒力因子的分泌，但对某些应用体内植入装置的患者可能会促进生物膜的形成，增强耐药性。

在细菌生物膜形成的早期，外源性的AIP类物质可与表皮葡萄球菌的AI-2受体竞争性结合，激活或阻断agr群体感应系统，从而影响细菌生物膜的形成并调控毒力因子的产生；而当成熟细菌生物膜形成以后，其高度组织化的多细胞群体结构使外源性agr信号分子难以渗透，无法被细菌表面的感应部位识别。因此，外源性的AIP类药物的作用可能仅在感染早期有效。

生物膜形成及毒力因子的分泌机制十分复杂，在不同的环境下某些基因的作用可能完全不同，如icaR在氧分充足的情况下能上调生物膜形成，而在缺氧情况下却起抑制作用；在不同菌株间也存在差异，如arlR/S可能主要依赖对icaDCBA基因的调控实现对表皮葡萄球菌生物膜的作用，而在金黄色葡萄球菌中则可能是通过Sigma B途径来实现的[40]。

总之，表皮葡萄球菌生物膜的调节机制十分复杂，各调节系统间既相互联系又彼此制约，如何利用各系统间的相互作用抑制生物膜的形成，治疗生物材料植入感染仍需进一步研究。

利益冲突 无

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Research progress of forming mechanism of agrC on Staphylococcus epidermidis biofilm

Chen Peng,Ye Lianhua

Department of Thoracic Surgery,the 3rd Affiliated Hospital of Kunming Medical University(Tumor Hospital of Yunnan Province),Kunming 650118,China

Ye Lianhua,Email:lhye1204@aliyun.com

The formation of Staphylococcus epidermidis biofilm on the surface of medical biomaterials may resist the antibiotics treatment and cause chronic infection,which has become a research focus in recent years. Multiple genes constitute complex regulatory network which affect the biofilm formation,and play different roles in the different stages of biofilm formation.Accessory gene regulator(agr)is one of the most important genes in the process of biofilm formation.The process of bacterial biofilm formation,research status of regulation mechanism of agr system and its related genes in the formation of biofilm are reviewed,to provide reference of using agr as a target for the treatment of staphylococcus epidermidis biofilm related infections.

Staphylococcus epidermidis; Bacterial biofilm; Accessory gene regulator; Gene regulation mechanism

叶联华，Email:lhye1204@aliyun.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．009

国家自然科学基金（81260228，81460278）；云南省自然科学基金（2013FZ276，2014FA048）；云南省高层次人才培养基金（2012HB032，D-201222）

2016-05-22）