非洲猪瘟检测技术研究进展

2016-03-11王子坚贺奋义郭慧琳魏润生甘肃省动物疫病预防控制中心甘肃兰州730046

国外畜牧学(猪与禽) 2016年1期

关键词：非洲猪瘟鉴别诊断检测技术

王子坚，贺奋义，郭慧琳，魏润生(甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州　730046)

非洲猪瘟检测技术研究进展

王子坚，贺奋义，郭慧琳，魏润生
(甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州730046)

摘要：非洲猪瘟是一种外来疫病，在我国存在输入性风险。本文介绍了非洲猪瘟几种诊断方法的研究进展，为该病的诊断和有效防控提供了理论依据。

关键词：非洲猪瘟；鉴别诊断；检测技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)又称非洲猪瘟疫，是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的一种严重危害猪及野猪的动物传染病，其病程短，死亡率高达100 %。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求报告的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中列为一类动物疫病[1-3]。我国目前尚未有发生本病的报道，但由于我国是以农业为主的养猪大国，国际贸易往来频繁，存在输入性风险。因此，掌握ASF诊断方法，对防止ASF的传入具有重要意义。

1　非洲猪瘟的诊断

非洲猪瘟综合症状复杂，在临床上难以和猪瘟区别诊断。猪感染ASFV后虽可产生特异性抗体，但这些抗体没有中和作用，也缺乏有效的保护性。耐过猪对同型毒株的有抵抗力，但对异源毒株极为敏感，至今仍没有可预防的疫苗。抗凝血液、脾和淋巴结等是用于诊断非洲猪瘟的常用材料。送检样本时应尽量冷藏或浸于甘油盐水中。根据流行病学、临诊症状和病理剖解可对ASF做初步诊断，确诊可通过病原学检测、血清学检测和分子生物学检测[4,5]。

1.1 非洲猪瘟的临床症状

猪感染ASFV后的潜伏期一般为5 d～15 d，根据感染毒株毒力的不同，临床症状可分为最急性、急性、亚急性和慢性四种类型。最急性型由强毒株感染引起，常无临床症状突然死亡，死亡率高达100 %。急性型病猪体温40.5 ℃～42 ℃，以高热、出血和高死亡率为特征，精神沉郁，食欲减退，运动失调，局部皮肤发红或发蓝、可视黏膜潮红、眼有分泌物、呕吐、腹泻、咳嗽、呼吸困难和怀孕母猪流产等症状，死亡率可达100 %。亚急性型由中等毒力毒株感染引起，症状较轻，病死率较低，间断性发热持续1个月之久，呼吸窘迫、关节疼痛、肿胀，怀孕母猪常常流产。慢性型由低毒力毒株感染引起，除波状热、生长减慢、发育迟缓或瘦弱外，不表现明显的症状。

1.2 非洲猪瘟实验室检测

1.2.1 非洲猪瘟的病原学检测

非洲猪瘟病原学诊断主要包括病毒分离、荧光抗体试验(FAT)、双抗体夹心ELISA等诊断技术。

病毒分离：非洲猪瘟病毒的分离要在具有三级生物安全(BSL-3)以上的生物安全实验室中进行，分离样本可以是猪血液及器官组织，包括脾脏、肝脏、肺脏及心脏。猪外周血单核细胞是常用的初次分离病毒的细胞，感染ASFV时，单层猪外周血单核细胞具有血细胞吸附特性及细胞死亡，以此来指示分离的病毒呈阳性。

荧光抗体试验(FAT)：非洲猪瘟抗原能够与标记有荧光素的抗ASFV特异性抗体相结合，用于野外可疑猪或实验室接种猪病变组织的ASFV抗原检测，也可以用于鉴定无红细胞吸附能力的毒株及区分非洲猪瘟病毒和伪狂犬病毒在细胞上形成的细胞病变。虽然该方法检测快速、敏感性和特异性都高，但是由于实验需要昂贵的荧光显微镜和高质量的荧光标记抗体，再加上荧光素标记技术要求高，需要专业实验员，目前该方法仅作为诊断ASFV的辅助检测方法。

双抗体夹心ELISA：特异性单克隆抗体包被酶标板，加入待检样本后，如果样本中含有目的抗原，则抗原与单抗特异性结合，再加入抗原另一表位的酶标单抗，形成类似双抗体夹心复合物，加入底物显色后指示抗原的存在。Vidal等以抗非洲猪瘟病毒抗原性结构蛋白VP73蛋白的特异单克隆抗体为基础建立了夹心ELISA方法。INGENASA夹心ELISA试剂盒，以包被的P72(又称P73)单抗检测样本中的病毒抗原，可以检测血液及多种组织中的病毒抗原，特异性、敏感性均很好，是OIE指定的ASFV检测试剂盒。算，从而评价阳性样本抗体含量及结合力，与间接ELISA或夹心ELISA结果相反，显色反应后阳性样本检测孔呈色浅，OD值低。该方法的出现为非洲猪瘟的诊断提供了一种无感染性的实验室诊断方法，特别是对于还没有发生非洲猪瘟疫情的国家来讲更具有现实意义，INGENASA阻断ELISA试剂盒，以VP73病毒蛋白为包被抗原检测非洲猪瘟特异抗体，为OIE指定参考的非洲猪瘟诊断试剂盒。

1.2.3 分子生物学检测方法

1.2.2 血清学检测方法

血清学检测方法有间接免疫荧光试验、血凝试验、竞争ELISA或阻断ELISA等。

免疫荧光试验的优点是敏感性高和快速，但难以实现对样本的大批量检测，且自动化程度不高。FAT的优点是简单、特异，灵敏。但是荧光素存在非特异性染色的弊端，导致试验结果出现假阳性。所以FAT被OIE列为检测ASF的辅助方法。

血凝试验具备的优点是灵敏度高，可以有效地降低假阳性率，可靠性强。缺点是费时，不易操作，对红细胞的新鲜度有要求，实验效果也受到细胞形态的直接影响，而且非血球吸附的毒株会导致假阴性，有一定的局限性，故该方法很难在ASF感染的早期做出检测，只能作为辅助检测。

竞争ELISA或阻断ELISA：利用待检血清样本与特异酶标单抗同时或先后与包被抗原结合反应，如果待检血清当中含有针对抗原的特异性抗体，将会抑制包被抗原与单抗的结合，样本抑制率根据阴阳性样本的OD值计

核酸检测：基于多聚酶链式反应(PCR)的核酸检测技术，具有易操作、敏感性高、特异性强、对样本要求不高等优点，能够实现早期诊断，是非疫区检测疫病的重要手段之一。根据ASFV基因组中含有的高度保守基因序列设计特异性引物进行扩增达到ASFV核酸的检测目的。PCR技术不仅快速、灵敏，而且对检测样本来源要求较低，组织、血液、分泌物等都可以作为ASFV DNA的检测样本，能从出现临床症状前病猪采集的样本中检测病毒DNA，实现早期诊断。

随着分子生物学的发展，荧光定量PCR、多重PCR技术以及新兴的环介导恒等温核酸扩增技术(LAMP)等方法较普通PCR技术在ASFV核酸检测方面显示出了巨大的优势，并日益得到广泛的应用。

目前，成熟的PCR检测方法主要选取ASFV的P72基因作为目的基因，根据不同毒株P72基因的高度保守序列设计出引物，抽提样本中病毒的DNA作为模板，建立的PCR方法能够有效地检测出脾脏等组织中的病毒。John McKillen等建立的PCR方法，可以鉴别诊断出ASF和古典猪瘟[6]。在此基础上，Mckillen还建立了Real-time PCR，与普通PCR相比，其灵敏度和特异性更强，对样本中的核酸可以做到实时定量检测，同时可有效降低电泳过程中琼脂糖凝胶对PCR结果的影响，结果更加直观。国内的蒋正军、孙怀昌等也建立了Taq Man探针，取得了良好的效果。但该方法的缺点是定量PCR仪价格昂贵，成本较高，对试验耗材要求高，偶尔会产生假阳性的结果。

Bastos等通过设计的两对引物，建立了巢式PCR，再次从普通PCR检出结果为阴性的60份样本中，检测出近20份阳性[7]。该方法也可用于检测软蜱体内的ASFV，灵敏度良好。在灵敏度方面，相比于传统的病毒分离法和OIE的PCR方法，Bastos等建立的巢式PCR更有优势。江彦增等建立了ASFV的等温环介导扩增法，在爆发疫情的野外和不具备试验条件的地区，该方法亦可对ASFV进行检测[8]。