间充质干细胞旁分泌效应在缺氧缺血性脑损伤中的应用

刘慧娟，戴王娟，康树敏，蒋犁

(东南大学附属中大医院 儿科，江苏 南京　210009)



间充质干细胞旁分泌效应在缺氧缺血性脑损伤中的应用

刘慧娟，戴王娟，康树敏，蒋犁

(东南大学附属中大医院 儿科，江苏 南京210009)

[摘要]间充质干细胞(MSCs)旁分泌的生物活性因子广泛参与免疫调节、神经炎症反应、细胞增殖与凋亡、内源性前体细胞再生、血管再生等多种病理生理过程，MSCs旁分泌效应在在修复新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBI)过程中发挥重要的作用，有望成为治疗HIBI优良的种子细胞。作者就MSCs旁分泌效应在修复缺氧缺血性脑损伤中的应用作一综述。

[关键词]间充质干细胞； 旁分泌； 新生儿； 缺氧缺血； 脑损伤； 文献综述

新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBI)是新生儿脑损伤的主要形式[1]。脑损伤相关机制有小胶质细胞激活、神经炎症反应、氧化应激、通过损伤相关分子模式(DAMPs)激活Toll样受体[2- 3]。这些环节形成细胞网络及细胞因子网络，造成全脑损伤。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治疗脑损伤能减少脑损伤面积、促进神经功能恢复。作者对近年来MSCs通过旁分泌作用修复脑损伤的机制作一综述，为MSCs移植治疗HIBI提供实验依据。

1MSCs分泌的生物活性因子及MSCs移植治疗HIBI的现状

MSCs在体外易分离培养、扩增，同种异体移植后免疫原性低，可以定向归巢作用于脑损伤部位发挥作用[4- 5]，是理想的种子细胞。MSCs旁分泌的生物活性因子主要有：(1) 生长因子及其受体。包括血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素(Ang)1、2，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，转化生长因子-β(TGF-β)，表皮生长因子及VEGF受体- 1(VEGFR- 1)等。(2) 细胞因子和趋化因子。包括白细胞介素- 10(IL- 10)、白细胞介素- 1(IL- 1)、肿瘤坏死因子(TNF)及趋化因子等；(3)调节肽及其他活性因子，包括降钙素、CXCR4等。这些因子在修复HIBI过程中发挥重要的作用。

研究MSCs移植治疗HIBI主要集中在两点：(1) 利用分化潜能在损伤区域直接分化代替受损细胞[6]；(2) 利用其分泌的多效细胞因子，发挥旁分泌作用，刺激内源性营养及修复机制的启动[7]。当前研究已证实，MSCs替代损伤组织的可能性极小[8]。外源性MSCs主要参与免疫调节、神经炎症反应、细胞增殖与凋亡、内源性前体细胞再生、血管再生等过程[9]。

2MSCs通过旁分泌作用修复HIBI的可能机制

2.1免疫调节与神经炎症反应调控

小胶质细胞的激活在神经系统炎症反应中起关键作用，被激活的小胶质细胞产生大量的神经毒性物质，如TNF-α、干扰素-γ、IL- 1β，活性氧/活性氮类和谷氨酸盐等，形成级联网络，参与脑损伤的发生、发展[2]。研究发现，予以HIBI幼鼠移植MSCs治疗后，脑组织的小胶质细胞数量较未移植组明显下降，神经炎症反应得到抑制，损伤面积减小，证明MSCs能对抗过度炎症反应[10]；而且移植MSCs治疗HIBI的模型组促炎因子TNF-α和IL- 1β含量比未移植组明显降低[11]。对MSCs抗炎机制的认识主要有以下3种[12]：(1) MSCs被激活，表达IL- 1受体拮抗剂，阻碍IL- 1发挥作用。(2) 形成负反馈环路：TNF-α及其他炎症细胞分泌的促炎因子刺激MSCs表达抗炎基因——TSG- 6，TSG- 6可负反馈抑制炎症细胞NF-κB信号通路，阻止炎症级联反应的发生。研究已证实，NF-κB是与脑损伤密切相关的细胞内转录因子，其使效应细胞活化释放促炎因子导致过度炎症反应[3]。(3) 形成第2个负反馈环路：通过受损组织及巨噬细胞产生的TNF- α、NO和其他DAMPs激活MSCs分泌前列腺素E2，促使巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转换，转换表型后的巨噬细胞可分泌IL- 10，抑制炎症反应。

MSCs可通过细胞间直接接触及旁分泌效应抑制特异性和非特异性免疫，发挥调节作用[5]。有报道MSCs与免疫细胞共培养后，IL- 10等可溶性免疫调节因子生成增加[13]。研究证明，TNF- α/NF- κB信号通路在MSCs免疫调节功能中起到关键作用，激活TNF- α/NF- κB信号通路会介导MSCs的免疫抑制功能，而沉默NF- κB或TNF- α受体基因的表达后，MSCs免疫抑制能力消失[14]。

2.2抗凋亡作用

研究认为，继发性神经元凋亡与激活caspase- 3引起级联放大反应有关。对损伤反应进行适当干预可逆转神经元的凋亡[15]。一项研究表明，在7日龄大鼠HIBI模型中，移植MSCs组在移植1 d后与未移植组相比，起细胞凋亡执行者作用的caspase- 3活性明显降低，同时具有神经营养作用的BDNF基因上调，脑损伤区域成熟神经元数量显著增多，说明处于凋亡边缘的受损神经元凋亡明显减少[16]。而将BDNF基因修饰的MSCs与单纯MSCs分别移植HIBI模型大鼠后，发现前者的抗凋亡效果更佳[17]。另外，Kim等[18]研究发现，MSCs移植到HIBI模型后，TUNEL检测显示重度脑损伤部位的细胞凋亡受到抑制；MRI显示病变程度减轻。

2.3促进内源性前体细胞再生

Yang等[19]研究发现，大脑存在内源性再生机制，缺血性脑损伤会刺激内源性神经干细胞的增殖和分化，但再生作用较为局限。Van Velthoven等[10]将MSCs经脑室移植到3日龄的HIBI模型小鼠后，大脑病变半球中BrdU阳性细胞数量增加，海马区和皮层新近分裂的神经元和少突胶质细胞数量亦有所增加，而检测发现外源性MSCs增殖率不足1%。说明近期分裂的细胞并非来自外源性MSCs。MSCs移植治疗21 d后，神经元、少突胶质细胞丢失分别减少了42%和31%，脑损伤面积显著减少，运动功能及发育状况明显改善。研究认为，移植MSCs主要是通过分泌多种营养因子刺激内源性干细胞增殖和分化、增强轴突可塑性并加强神经元之间的信号传递来促进损伤修复的。此外，有实验对单剂量和重复剂量移植MSCs治疗HIBI小鼠的效果进行研究比较，发现单次移植MSCs存活数量非常有限，而重复移植MSCs对促进皮质脊髓束重建的效果较为明显；检测发现，在重复剂量移植MSCs组，与神经系统发育、神经再生、轴突生长相关的基因上调明显[7]。新的研究表明，MSCs也可通过音猬因子信号通路介导内源性神经干细胞的增殖[20]，进一步证实外源性MSCs可通过旁分泌效应诱导脑中内微环境变化以促进内源性细胞增殖、分化,修复损伤。

2.4促进血管再生，改善组织灌流

应用干细胞治疗缺氧缺血脑损伤(HI)模型大鼠发现，与血管生成密切相关的VEGF及VEGF mRNA含量明显增多，同时闭合蛋白含量增加，其中VEGF含量是未移植组的4倍。这些因子共同参与损伤部位血管再生、重建，改善受损区域血供、增加氧和营养物质的供给[16]。CXCR4/SDF- 1α轴在MSCs旁分泌VEGF过程中也发挥重要作用，MSCs过表达CXCR4(MSCsCXCR4)联合SDF- 1α通过激活MSCs内Akt信号通路可以促进VEGF分泌。体外将MSCsCXCR4联合SDF- 1α与静脉内皮细胞共培养发现，MSCsCXCR4分泌的VEGF通过激活内皮细胞上的VEGF受体2及其下游信号通路发挥其生物学功能。后期在体实验将MSCsCXCR4移植到脑损伤小鼠体内，21 d后损伤部位有广泛的血管重建和血流灌注，这说明MSCsCXCR4旁分泌的VEGF对促进脑损伤后血管重建发挥了重要作

用[21]。

2.5趋化作用

有实验研究比较人神经前体细胞与人脐带血MSCs分泌谱发现，后者趋化因子CCL2、CCL7及CXCL1、CXCL8高表达(P<0.01)。将MSCs移植入7日龄HI模型大鼠，7 d后移植细胞仍然表达CCL3及CXCL1。同时移植MSCs组脑损伤区域的巢蛋白标记的细胞数量增加，MRI显示脑梗死面积减少，说明脑损伤早期趋化因子能诱导神经祖细胞向损伤区迁徙，促进损伤的修复[22]。

3总结与展望

综上所述，MSCs移植有望成为治疗HIBI的有效方案。但目前仍有许多问题尚未解决，如修复病变的机制仍不明，MSCs的来源和数量、移植途径、移植时间窗及移植后长期安全性、有效性等尚无明确标准。在这些问题未得到妥善的解决之前，MSCs广泛应用于临床仍然任重而道远。

[参考文献]

[1] KIRBY R S.Cerebral palsy and birth defects:what is the frame of reference？[J].Dev Med Child Neurol，2012,54(8):677- 678．

[2] RITZEL R M,PATEL A R,GRENIER J M,et al.Functional differences between microglia and monocytes after ischemic stroke[J].J Neuroinflammation，2015,12(1):106．

[3] ENGELMANN C,WEIH F,HAENOLD R.Role of nuclear factor kappa B in central nervous system regeneration[J].Neural Regen Res，2014,9(7):707- 711．

[4] 王诗雨，朱丽华，摆翔，等.基质细胞衍生因子- 1及CXC家族趋化因子- 4在人脐带间充质干细胞干预新生大鼠脑白质损伤中的作用[J].中华围产医学杂志,2014,17(5)．

[5] LOTFINEGAD P,SHAMSASENJAN K,MOVASSAGHPOUR A,et al.Immunomodulatory nature and site specific affinity of mesenchymal stem cells:a hope in cell therapy[J].Adv Pharm Bull，2014,4(1):5- 13．

[6] MEZEY E,CHANDROSS K J,HARTA G,et al.Turning blood into brain:cells bearing neuronal antigens generatedinvivofrom bone marrow[J].Science，2000,290(5497):1779- 1782．

[7] Van VELTHOVEN C T,KAVELAARS A,Van BEL F,et al.Mesenchymal stem cell transplantation changes the gene expression profile of the neonatal ischemic brain[J].Brain Behav Immun，2011,25(7):1342- 1348．

[8] PHILLIPS A W,JOHNSTON M V,FATEMI A.The potential for cell- based therapy in perinatal brain injuries[J].Transl Stroke Res，2013,4(2):137- 148．

[9] RAHIMZADEH A,TABATABAEI M F,MOVASSAGHPOUR A,et al.Biotechnological and biomedical applications of mesenchymal stem cells as a therapeutic system[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol，2014:1- 12．

[10] Van VELTHOVEN C T,KAVELAARS A,Van BEL F,et al.Mesenchymal stem cell treatment after neonatal hypoxic- ischemic brain injury improves behavioral outcome and induces neuronal and oligodendrocyte regeneration[J].Brain Behav Immun，2010,24(3):387- 393．

[11] GU N,RAO C,TIAN Y,et al.Anti- inflammatory and anti-

apoptotic effects of mesenchymal stem cells transplantation in rat brain with cerebral ischemia[J].J Stroke Cerebrovasc Dis，2014,23(10):2598- 2606．

[12] PROCKOP D J,OH J Y.Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs):role as guardians of inflammation[J].Mol Ther，2012,20(1):14- 20．

[13] CHEN K,WANG D,DU W T,et al.Human umbilical cord mesenchymal stem cells hUC- MSCs exert immunosuppressive activities through a PGE2- dependent mechanism[J].Clin Immunol，2010,135(3):448- 458．

[14] DORRONSORO A,FERRIN I,SALCEDO J M,et al.Human mesenchymal stromal cells modulate T- cell responses through TNF- alpha- mediated activation of NF- kappaB[J].Eur J Immunol，2014,44(2):480- 488．

[15] ROSENKRANZ K,MEIER C.Umbilical cord blood cell transplantation after brain ischemia—from recovery of function to cellular mechanisms[J].Ann Anat，2011,193(4):371- 379．

[16] ROSENKRANZ K,KUMBRUCH S,TENBUSCH M,et al.Transplantation of human umbilical cord blood cells mediated beneficial effects on apoptosis,angiogenesis and neuronal survival after hypoxic- ischemic brain injury in rats[J].Cell Tissue Res，2012,348(3):429- 438．

[17] JEONG C H,KIM S M,LIM J Y,et al.Mesenchymal stem cells expressing brain- derived neurotrophic factor enhance endogenous neurogenesis in an ischemic stroke model[J].Biomed Res Int，2014,2014:129145．

[18] KIM E S,AHN S Y,IM G H,et al.Human umbilical cord blood- derived mesenchymal stem cell transplantation attenuates severe brain injury by permanent middle cerebral artery occlusion in newborn rats[J].Pediatr Res，2012,72(3):277- 284．

[19] YANG Z,COVEY M V,BITEL C L,et al.Sustained neocortical neurogenesis after neonatal hypoxic/ischemic injury[J].Ann Neurol，2007,61(3):199- 208．

[20] WANG X,ZHAO Y,WANG X.Umbilical cord blood cells regulate the differentiation of endogenous neural stem cells in hypoxic ischemic neonatal rats via the hedgehog signaling pathway[J].Brain Res，2014,1560:18- 26．

[21] WANG Z,WANG Y,WANG Z,et al.Engineered mesenchymal stem cells with enhanced tropism and paracrine secretion of cytokines and growth factors to treat traumatic brain injury[J].Stem Cells，2015,33(2):456- 467．

[22] BAE S H,KONG T H,LEE H S,et al.Long- lasting paracrine effects of human cord blood cells on damaged neocortex in an animal model of cerebral palsy[J].Cell Transplant，2012,21(11):2497- 2515．

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.029

[中图分类号]R722.1

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)02- 0257- 03

[通信作者]蒋犁E- mail:jiangli77777@126.com

[作者简介]刘慧娟(1989-)，女，安徽阜阳人，在读硕士研究生。E- mail：huijuanliu9@163.com

[基金项目]国家自然科学基金(81370739)；江苏省自然科学基金(BK20131303)

[收稿日期]2015- 11- 24[修回日期] 2015- 12- 23

[引文格式] 刘慧娟，戴王娟，康树敏，等.间充质干细胞旁分泌效应在缺氧缺血性脑损伤中的应用[J].东南大学学报:医学版，2016，35(2)：257- 259.

·综述·