人凝血因子Ⅷ在基因工程中的研究进展

江婉蓉 王珍 何遵卫

人凝血因子Ⅷ在基因工程中的研究进展

江婉蓉 王珍 何遵卫

目的 因原料血浆不足，作为治疗血友病A的唯一有效用药人凝血因子Ⅷ资源短缺，而运用基因工程生产的重组人凝血因子Ⅷ能很好的解决这些问题。本文从人凝血因子Ⅷ的结构改造、载体及表达系统、基因治疗和前沿基因编辑技术的应用等几个方面对FⅧ在基因工程中的研究进行总结及展望。

重组人凝血因子Ⅷ；基因工程；基因治疗

人凝血因子Ⅷ作为治疗凝血障碍性疾病血友病A的惟一有效用药，主要有两个来源。一是血浆离心后获得的冷沉淀中分离的人凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ，FⅧ)；二是通过基因改造获得的重组人凝血因子Ⅷ(recombinant FⅧ，rFⅧ)。而利用基因工程手段生产的rFⅧ相比于FⅧ具有以下优势：(1)不受原料血浆产量的限制；(2)患者接受治疗后感染病毒性肝炎和艾滋病等传染性疾病的风险更低；(3)产品的稳定性更强。李文卿[1]研究证实了重组人凝血因子Ⅷ在中国血友病A患者的治疗中具有较好的有效性、安全性及较低的抑制物产生率。所以，面对国内凝血因子Ⅷ短缺、进口国外的基因重组凝血因子产品价格相对昂贵的困境，提高凝血因子Ⅷ的产量和利用率是一方面，另外对重组人凝血因子Ⅷ的研究和开发，生产中国自己的人重组凝血因子Ⅷ的产品，具有广阔的应用前景和积极的意义。本文从人凝血因子Ⅷ的结构改造、载体及表达系统、基因治疗和前沿基因编辑技术的应用等几个方面对FⅧ在基因工程中的研究进行总结。

1 人凝血因子Ⅷ的结构及其改造

1.1 人凝血因子Ⅷ的结构 自Wood等[2]克隆人凝血因子Ⅷ的基因，解析了该基因的cDNA序列，并成功表达提取rFⅧ以来，FⅧ的基因和蛋白结构逐渐被人们所探知。FⅧ的基因由26个外显子和25个内含子组成，其中14和26两个外显子最大，分别为3 106 bp和1 958 bp，全长186 kb，位于X染色体长臂末端，约占整个X染色体的0.1%。FⅧ基因经过转录、剪切后的mRNA长约9 kb，编码一条包含2 351个氨基酸残基的前体。信号肽在内质网中被水解后，形成含有2 332个氨基酸残基，6个结构域的成熟FⅧ单链蛋白。

根据FⅧ内部序列的同源性的关系，FⅧ可分为A、B、C三种结构域,其中：A结构域可分为A1、A2、A3三种，每个约含350个氨基酸残基，具有30%的同源性，A1、A2位于重链，A3位于轻链；B结构域为重链，位于分子的中部，共有908个氨基酸残基；C结构域位于轻链的C端，分为C1、C2，每个约有150个氨基酸残基，具有40%的同源性。Stoilova-McPhie等[3]通过电子显微镜技术成功得到了FⅧ的晶体结构。FⅧ的A3区位于细胞膜磷脂双分子层且紧邻C1和C2区；C1区的长轴与细胞膜平面大约平行且与C2几乎垂直；A1、A2和A3区之间互有微小角度且均有2个高度保守的β桶装结构域。整个分子排列成A1-A2-B-A3-C1-C2[4]。通过与细胞内外的多种结构的蛋白和酶之间复杂的相互作用，从而影响着FⅧ的蛋白质活性、跨膜转运和基因表达等。

1.2 人凝血因子Ⅷ结构的改造 尽管重组人凝血因子Ⅷ对于血友病A患者的治疗效果显著，但因人凝血因子Ⅷ的基因较大，表达水平低和极易降解等缺陷，寻找合适的途径和表达载体显得尤为重要。通过对FⅧ基因结构的改造，能有效的提高FⅧ在细胞中的表达。当前，对于对FⅧ基因结构的改造有以下几个方面：(1)缺失B区：FⅧ的B区结构域占整个分子的大约40%，但B区缺失型FⅧ与野生型FⅧ具有相似的生物学特征，FⅧ基因的B区在加工的过程中被剪切，其与基因表达和凝血功能等关系不大。且B区缺失型FⅧ没有载体包装容量的的缺陷，表达产物也更为简单朱甫祥等[5]研究了将FⅧ基因在大肠杆菌中分别表达的重链和轻链，利用内含子介导的蛋白剪切法进行拼接。随后，将促进重链分泌的基因区导入其中，经双载体共转染的方式，获得了高活性和高表达量的B区缺失型FⅧ。Pittman等[6]将FⅧcDNA的若干结构域去除后获得的B区缺失型FⅧcDNA插入逆转录病毒载体，基因的表达量不仅比野生型有较大程度提高，而且表达产物的生物特性及免疫原性与野生型相同。另外，美国辉瑞、韩国绿十字等几家医药公司已有B区缺失或保留B区部分氨基酸的重组FⅧ成功上市[7]。(2)定点突变：通过对氨基酸位点的定点突变，减少FⅧ在分泌途中与相关蛋白结合，从而提高其表达量；通过特定结构改造的FⅧ能抵制特定蛋白对其作用位点接切后的抑制，增强了FⅧ的稳定性。Wakabayashi等[8]通过对包埋在分子内部、带电荷较多的4个位点进行突变，突变产物相比于野生型的凝血活性和热稳定性均有很大程度的提高。细胞内蛋白的相互作用会抑制FⅧ的表达。 Miao等[9]设计了F309S的突变位点，降低FⅧ在分泌过程中与BiP的相互作用；有研究表明通过突变2个半胱氨酸的位点，消除了二硫键对分泌蛋白的影响，表达量均有显著提高[10]。(3)聚乙二醇修饰：聚乙二醇修饰又称PEG化，是将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，进而影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变。通过PEG化，能增强蛋白质分子化学稳定性，提高抵抗蛋白酶水解能力，降低蛋白免疫原性及延长蛋白在体内的半衰期。

进行PEG化的半胱氨酸残基在B区缺失型FⅧ中一共含有19个，其中16个以二硫键相互配对，另外3个包埋在分子内部。所以需要通过定点突变等方法引入新的半胱氨酸残基进行PEG化。Mei等[11]研究了不同位点引入单个半胱氨酸残基进行PEG化，结果表明，大多数经过PEG化的FⅧ突变体的生物活性与野生型效果相同，且在半衰期和治疗效果均优于野生型FⅧ。另外，在B区还有4个半胱氨酸残基，Turecek等[12]通过对重组全长的FⅧ进行定点PEG化，大部分修饰位点处于B区，经PEG化的FⅧ的结构和功能没有影响。因此，PEG化作为一个有效的手段，拜耳、百特等医药公司已有相关的定点氨基酸PEG化的重组FⅧ进入临床，以后将会给血友病A患者带来福音[7]。

另外，为延长重组FⅧ的半衰期，在FⅧ末端和B区缺失的FⅧ末端融合表达IgG的Fc片段；利用PEG化脂质体非共价包裹FⅧ等。FⅧ作为结构复杂的蛋白质药物，随着对FⅧ结构和功能的深入研究，将会研制出高效、安全、价廉的重组FⅧ产品。

2 重组FⅧ的表达载体及系统

通常的载体有三种，细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。它们是一类能将目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA或RNA分子。在重组FⅧ载体的构建中，这三种类型均有所应用，细菌质粒和动物病毒的应用更为普遍。病毒载体以其宿主范围广、载体容量大及操作简单等优势得到广泛应用，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒及单纯疱疹病毒等病毒载体均有相关研究报道。

表达系统中，原核生物表达系统操作简便，却在表达真核来源的重组FⅧ蛋白时存在一些缺陷，如二硫键的错误链接、肽链不能有效折叠及糖基化效率低等问题，故应用并不广泛。现今的研究关注更多的是真核微生物和动物细胞类的表达载体，王泽[13]将分泌性载体Ppic9导入甲醇诱导性毕赤酵母中进行重组FⅧ的表达，成功的表达出重组FⅧ，为重组FⅧ表达系统的扩展研究提供基础。孙夏瑜[14]通过克隆FⅧ基因的cDNA，利用杆状病毒-昆虫表达系统成功地制备了具有凝血活性的重组FⅧ。赵倩[15]通过构建含有BDDh FⅧ的重组真核表达质粒，转染入HepG2细胞中，得到了能稳定表达重组FⅧ的细胞株。生产应用最多的表达系统还是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，通过载体转染CHO，细胞培养后，通过亲和层析等蛋白分离技术获得重组FⅧ，有些产品已成功上市。

3 基因治疗

血友病A的主要发病机制是内含子22的倒位和错义突变。随着科学家对FⅧ基因和蛋白质结构的透彻研究，加之个体对FⅧ的正常生理水平要求较低，许多器官均能产生有活性的FⅧ。因此，血友病A作为体细胞基因治疗的首选疾病。

3.1 体外治疗 体外治疗指的是先从患者体内取出某一组织的细胞，通过体外扩增培养后，将携带有重组FⅧ基因的载体转染到受体细胞中，筛选出转染成功的细胞移植到患者体内，进而通过这些移植的细胞表达出FⅧ来达到治疗的目的。Van Damme等[16]将携带有B区缺失型FⅧ的逆转录病毒载体转染至人骨髓间充质细胞中，然后将成功转染的重组细胞移植到免疫缺陷的NOD-SCID小鼠中，重组FⅧ在小鼠体内的表达量对于治疗有显著价值。因病毒载体的不安全性，纤维细胞、成肌细胞等取材方便、体外扩增迅速的组织细胞在临床中得到应用。

3.2 体内治疗 体内治疗是指将能表达FⅧ的载体直接注入患者机体。目前最为安全的治疗方法是向患者体内直接注射不含载体的裸DNA，通过体内肝细胞的转染，自身表达FⅧ来进行治疗，这是一个比较有效的体内治疗方法。另外，通过转座子对哺乳动物基因的高效整合，将真核生物的含有FⅧ基因转座子载体导入受体体内，表达FⅧ达到治疗目的。但因转座子整合基因位置的不确定，这种方法的安全性还需进一步验证。刘雄昊[17]通过构建携带有h FⅧ-SK39的核糖体基因区靶向表达载体电转染至人肝细胞中，采用高水压注射法将载体直接通过尾静脉注射到裸鼠体内，结果显示该载体在小鼠体内得到有效表达，这为血友病的基因治疗开拓了新的思路并奠定了基础。

不得不提的是，随着最近几年一种全新的基因编辑技术CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)的诞生，科学家只需要设计一段几十个碱基的CRISPR，利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组的具体靶点上，便能对特定基因位点进行切割导致突变。这项技术应用在基因敲除、基因编辑相关的疾病、基因的激活和表达等多个领域。CRISPR/Cas9还可以作为一种精确的基因剪切工具运用在真核细胞的转录调控研究中。将CRISPR/Cas9应用在重组FⅧ的研究中，不仅能简化基因编辑操作步骤，更重要的是其精准的定位能极大了提高重组效率，减少因剪切带来的基因片段的残留或缺失，这可以提高转染成功率，同样在表达系统中能使表达的重组FⅧ正确折叠，进而提高重组FⅧ收率。CRISPR/Cas9在血友病A的基因治疗方面同样有革命性的应用前景，相信将这项技术应用在重组FⅧ的研究中将具有深远的意义。

在我国30多家血液制品生产厂家中仅有4家生产人凝血因子Ⅷ，且还没有国内公司生产重组FⅧ的产品，产量远远不能满足血友病患者的需求，进口的重组FⅧ以其安全、高效的优势已被越来越多的血友病患者所接受。通过转基因技术的进一步发展，相信在不久的将来，现今存在的受体产生免疫反应、插入突变及CRISPR/ Cas9的脱靶等问题将会得到解决，重组FⅧ的永久性表达的也将会实现。

1 李文卿.重组人凝血因子Ⅷ在中国血友病A患者的有效性及抑制物产生的追踪观察.血检与止血,2008,14:257-260.

2 Wood WI,Capon DJ,Simonsen CC,et al.Expression of active human factor VIII recombinant DNA clones.Nature,1984,312:330-337.

3 Stoilova-McPhie S,Villoutreix BO,Mertens K,et al.3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography.Blood,2002,99:1215-1223.

4 Shen B W,Paul Clint S,Chong-Hwan C,et al.The tertiary structure and domain organization of coagulation factor VIII.Blood,2008,111:1240-1247.

5 朱甫祥,刘泽隆,屈慧鸽,等.Ssp DnaB intein大肠杆菌中介导FⅧ重链和轻链的连接.生物工程学报,2009,25:1101-1106.

6 Pittman DD,Alderman EM,Tomkinson KN,et al.Biochemical,immunological and in vivo functional characterisation of B-domain-deleted factor Ⅷ.Blood,1993,81:2925-2935.

7 江海燕,应跃斌,王海彬,等.重组人凝血因子Ⅷ结构改造的研究进展.药物生物技术,2015,22:69-73.

8 Wakabayashi H,Varfaj F,Deangelis J,et al.Generation of enhanced stability factor VIII variants by replacement of charged residues at the A2 domain interface.Blood,2008,112:2761-2769.

9 Miao HZ,Sirachainan N,Palmer L,et al.Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion.Blood,2004,103:3412-3419.

10 Selvaraj SR,Scheller AN,Miao HZ,et al.Bioengineering of coagulation factor VIII for efficient expression through elimination of a dispensable disulfide loop.Journal of thrombosis and haemostasis,2012,10:107-115.

11 Mei B,Pan C,Jiang H,et al.Rational design of a fully active,long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment.Blood,2010,116: 270-279.

12 Turecek PL,Bossard MJ,Graninger M,et al.BAX 855,a PEGylated rFVIII product with prolonged half-life.Hamostaseologie,2012,32:529-538.

13 王泽.凝血因子Ⅷ在毕赤酵母中的表达.河南师范大学,2011.27.

14 孙夏瑜,李杰,武坚锐,等.重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定.中国优生与遗传杂志,2014,20:19-20.

15 赵倩.重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达.天津医科大学,2012.19.

16 Van Damme A,Chuah MKL,Dell'Accio F,et al.Bone marrow mesenchymal cells for haemophilia A gene therapy using retroviral vectors with modified long-terminal repeats.Haemophilia the Official Journal of the World Federation of Hemophilia,2003,9:94-103.

17 刘雄昊.利用携带人凝血因子Ⅷ的核糖体基因区打靶载体进行血友病A基因治疗的研究.中南大学,2007.23.

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.035

430000 湖北省武汉市中医医院(江婉蓉)；武汉中原瑞德生物制品有限责任公司(王珍、何遵卫)

R 349.83

A

1002-7386(2016)24-3800-03

2016-04-12)