内外源性应力对间质干细胞成软骨分化的调控

邱静怡 万凌云 赵志河 李娟

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院正畸科（四川大学） 成都 610041

内外源性应力对间质干细胞成软骨分化的调控

邱静怡 万凌云 赵志河 李娟

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院正畸科（四川大学） 成都 610041

间质干细胞（MSC）来源的多元性为诱导其成脂向分化、成肌向分化、成骨向分化和成软骨向分化奠定了生物学基础，诱导MSC成软骨向分化受化学刺激和力学刺激等因素的调节。外源性应力和内源性应力是力学刺激的两种基本形式，改变细胞外基质（ECM）硬度、细胞形态、ECM纳米形貌和细胞密度等内源性应力，加载单纯压缩力、压缩力、联合剪切力、牵张力和流体静压力等外源性应力，均对MSC成软骨向分化有不同程度的影响；因此，深入研究内外源性力学刺激调控MSC成软骨分化的效应及机制，对于促进软骨再生和修复，既必要也可行。本文就内外源性应力对MSC成软骨向分化的调控等研究进展作一综述，旨在为后续的研究提供参考。

间质干细胞； 力学刺激； 力学信号转导； 干细胞分化； 成软骨分化

骨关节炎是一种以反复关节疼痛和渐进性功能障碍为主要临床表现的中老年常见疾病。至2008年，中国60岁以上人口逾1.85亿，其中罹患骨关节炎者达5 000万并逐年上升[1]。由于软骨仅靠关节滑液提供大部分的营养，难以自身修复，因此迄今对骨关节炎的治疗仍以对症治疗为主，

为了更好地将MSC应用于软骨组织缺损的修复，大量致力于更高效、稳定地诱导MSC成软骨向分化的研究发现，MSC的分化受多因素调节，但总体上分为化学刺激和力学刺激两大类。以往诱导MSC成软骨分化的常规方法是添加转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β和碱性成纤维细胞生长因子等[9]，但单纯的化学刺激很难有效地维持其软骨分化表型[10]。

随着学科的交叉与融合，机体的力学过程与生物学过程之间的相互关系被广泛研究，力学刺激及随后的力学转导过程在决定干细胞命运、维持其分化表型上的作用得到了证实[11]。大量学者通过加载各种机械应力刺激来调控MSC的成软骨分化过程，取得了明显的成效。外源性应力和内源性应力是机械应力刺激的两种基本形式。通过改变细胞外基质（extracellular matrix，ECM）硬度、细胞形态、ECM纳米形貌和细胞密度等内源性应力，加载单纯压缩力、压缩力、联合剪切力、牵张力和流体静压力等外源性应力，均对MSC成软骨向分化有不同程度的影响[12-13]；因此，深入研究内外源性力学刺激调控MSC成软骨分化的效应及机制，对于促进软骨再生和修复，是必要且可行的。本文就内外源性应力对MSC成软骨向分化的调控等研究进展作一综述，旨在为后续的研究提供参考。

1 内源性应力对MSC成软骨分化的调控

ECM是细胞赖以生存的生物微环境。ECM可通过影响细胞的黏附、铺展、迁移、增殖、分化和程序性死亡来调控细胞的行为，ECM还可通过强化ECM配体和细胞受体间的交互作用，从而调控MSC向不同方向分化[14]；当然，这一系列的力学信号转导基础尚不清楚。细胞生长环境力学特性的改变也会启动细胞内的力学转导过程，这些统称为内源性应力或细胞生成力[15]。越来越多的研究显示，以ECM硬度、基质地表形貌和细胞固有形态为代表的内源性应力可调控MSC的分化方向并有助于其表型稳定。

1.1 ECM硬度

ECM硬度是细胞微环境中最重要的内源性应力来源。细胞通过细胞骨架黏附于ECM表面形成黏附斑；而ECM硬度的改变可解聚黏附斑的肌动蛋白-肌球蛋白纤维张力，改变细胞与基质之间的黏附力并将其转化为化学刺激，完成内源性力学转导过程。Engler等[16]构建了由1型胶原蛋白表面修饰且硬度区间不同的PAAm凝胶培养基，在化学刺激相同时，ECM硬度决定MSC的分化方向：当ECM的硬度与脑组织硬度相同时（约1 kPa），可诱导MSC成神经元向分化；当ECM的硬度与骨骼肌硬度相同时（约10 kPa），可以诱导MSC成肌向分化；当ECM的硬度与胶质骨硬度相同时（约100 kPa），可诱导MSC成骨向分化。更值得关注的是，ECM硬度刺激对MSC分化表型的维持作用。在特定ECM硬度刺激诱导的前7 d，MSC即出现相对应的初始分化表型，若在此时加入其他分化方向的转录因子，MSC将转向化学诱导方向分化；然而在ECM硬度刺激持续诱导3周后，任何转录因子的加入都无法改变其已有的分化方向[11,16]；因此在长时间诱导的情况下，内源性力学刺激对MSC分化方向的调控作用更加持续，对分化表型的维持更加稳定，具有更广阔的应用前景。

ECM硬度对干细胞成骨、成肌、成神经分化都具有明确的调控及维持效应，那么ECM硬度能否调控MSC成软骨分化呢？2011年，Park等[17]分别在ECM硬度值为1 kPa的1型胶原蛋白凝胶上及ECM硬度约为2 GPa的1型胶原蛋白冲洗过的培养皿上分别培养MSC，以系统探究ECM硬度对MSC分化的影响。结果显示：MSC在软基质中培养后，软骨细胞标志物2型胶原蛋白及脂肪细胞标志物脂蛋白脂肪酶表达均上调；在添加TGF-β后，MSC在软基质上向成软骨方向分化的趋势进一步增加，而成脂向受到抑制，在较硬基质（15 kPa）上则成肌向分化。2012年，Toh等[18]运过氧化氢对透明质酸-酪胺酸偶联物的交联度进行调控，得到了ECM硬度值为5.4、9.5、11.8 kPa的三种基质并且发现，MSC在ECM硬度为5.4 kPa的较软基质中，黏多糖和2型胶原蛋白明显增多，即MSC在此ECM硬度区间为成软骨向分化。Kwon等[19]发现，即使不添加成软骨诱导因子，MSC在低硬度（约1 kPa）的磺化培养基上培养后，诸如2型胶原蛋白α1、聚集蛋白聚糖和Sox9等成软骨标志物的表达也明显高于硬基质。Xue等[20]的研究也得出了相同的结果。以上研究充分说明，ECM硬度可调控MSC的成软骨分化。

目前，越来越多的研究[21-24]显示，力学信号通过整联蛋白、细胞骨架系统和RhoA通路调控MSC的增殖和分化。ECM硬度通过改变细胞骨架张力纤维的结构，调节其张应力的大小；而细胞骨架张应力的改变，可激活RhoA和Rho相关的卷曲蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK）信号转导通路来调节细胞的分化方向，RhoA和ROCK两者之间存在着大量偶联的正负反馈调节机制。同时，Hippo信号转导通路的经典信号分子酵母相关蛋白和TAZ（tafazzin）被认为参与ECM调控细胞分化命运的过程[25]。

1.2 细胞形态及ECM的纳米形貌

ECM是细胞生长微环境中的重要组成部分，在细胞铺展、迁移、增殖、分化的过程中，细胞会受到来自ECM的多种力学刺激，如拉应力、压应力、流体剪切力、渗透压力信号的刺激，细胞可以识别微环境中这些微小甚至是纳米级别的力学改变，从而转变自身的细胞形态。早在1978年Folkman等[26]就发现，细胞形态是细胞生长增殖及生理特性的重要调节器，同时细胞形态可影响胚胎初期的生长发育及干细胞的分化方向。细胞形状的改变可以改变细胞内的力学信号转导过程，从而对心肌细胞的生长产生影响[27]，而ECM改变所带来的细胞形态变化也是毛细血管内皮细胞生长分化变异的诱因之一[28]。深入的研究[29-30]证实，人工合成的ECM可以改变细胞形态，调控MSC成软骨向定向分化；且在局限的区域内培养细胞，细胞形状对细胞分化的调控作用要大于ECM硬度对其的影响。引起细胞形态改变的内外源性因子与决定细胞分化方向的信号通路间存在着偶联效应，同时细胞形态变化也会引起细胞生长微环境中应力刺激及渗透压等的变化，这些改变也激活了部分细胞分化信号转导通路，使细胞获得了不同的分化趋势[31-34]。

1.3 细胞密度

在体外诱导MSC成软骨分化时，为了还原软骨胚胎发育时的细胞聚集状态，需要大约107个每毫升的MSC高接种密度，以便进一步提高软骨再生修复的成功率及效率。研究[23]显示，高细胞接种密度促进MSC的成脂、成软骨向分化，而低细胞接种密度则有利于MSC成骨向分化。Xue等[20]发现，ECM硬度与细胞密度间也有交互作用，两者结合，共同决定了MSC的分化方向：当细胞密度高达每平方厘米20 000个时，MSC的培养环境无论软硬，其细胞形态及相关表达分子的测定数据均无明显差异；而当细胞接种密度低至每平方厘米1 000个时，MSC在软性基质中的成软骨分化标志分子与硬性基质中相比较有所上调。该研究结果与上文所提及的软基质硬度促进MSC成软骨向分化的众多研究结果相符，而这些研究结果也说明，适当的细胞接种密度有利于ECM产生更多的促MSC成软骨向分化的功能蛋白，从而使MSC分化早期细胞与完全成熟的软骨细胞更加相似。

2 外源性应力对MSC成软骨分化的调控

除了内源性应力之外，作为一种更加直接的刺激方式，外源性力学刺激对关节软骨的形成和维持也起着重要的作用。一直以来，学者们为了更好地研究不同力学刺激在软骨组织工程中的应用，开发了不同种类的生物反应装置，以求最大程度的模拟生物体内关节的受力状态。学者们运用动态压缩力、循环流体静压力、周期性牵张力和层流剪切力等从单轴向和多轴向进行力学加载，从而模拟软骨在的关节内的复杂力学环境，以此研究机械性外力对MSC成软骨分化的影响。

2.1 压缩力

关节组织在机械运动过程中会不断对软骨组织产生压缩力，故而压缩力对软骨分化的影响一直是研究者探索的热点。近年来大量的研究[35-38]也不断地证实，压缩力对MSC成软骨分化的调控有重要作用。该调控过程与多种影响因素有关，其中研究最广的是加力时间点。

Li等[39-40]发现化学刺激8 d后，延迟动态压缩力对MSC成软骨分化诱导明显，且其作用与化学诱导相似。Thorpe等[41]也发现对细胞加载动态压缩力的时间重要性，在细胞分化早期加载动态压缩力反而会抑制细胞向软骨和肌等分化。也有研究[42]显示，延迟动态压缩力对人MSC（human mesenchymal stem cell，hMSC）成软骨分化有促进作用。可见，在正式的力学加载前通过化学诱导方法使细胞软骨表型和ECM初步建立，更有利于其后续软骨基质特异性基因的表达。延迟动态压缩力可能是通过增强细胞内源性化学因子活性、激活其下游信号，从而与化学诱导起协同作用，诱导细胞成软骨分化的[39]。另外，动态压缩力还可促进MSC软骨分化早期细胞增殖和活性，这也是干细胞分化的先决条件[43]。此外，在动态压缩力作用下培养体系的局部空间位置，也对MSC成软骨分化相关基因表达、ECM的形成有影响[38]。压应力调控MSC成软骨分化是一种复杂的力—化学—生物学过程，仍有许多影响因素还不清楚，其详细的分子机制尚待深入研究。尽管以上研究结果都支持了单纯压缩力对MSC成软骨分化的诱导作用，但因机体内软骨组织受力组成复杂，单纯压缩力难以真实模拟软骨细胞的力学模型，故有研究者对此力加载模型进行了改进。

2.2 压缩力联合剪切力

机体进行关节运动时，会同时产生压缩力和剪切力；因此单纯地加载其中任何一种机械力到细胞培养体系上，都无法完全模拟关节的真实力学运动，也无法为MSC形成软骨向分化提供足够的力学刺激信号[44]；但表面剪切力可以促进关节内液体流动，进而有利于生物力学信号的传导和营养物质代谢产物的交换，影响成软骨的分化。

2011年，Schätti等[44]将表面剪切力重叠于循环轴向压缩力，在培养基不添加任何生长因子的条件下作用于人骨髓MSC发现，基质黏多糖合成增加且随时间变化合成量相对恒定，同时软骨相关基因及其蛋白质表达上调。他们以为相较于单轴向力学作用，多轴向的联合力学加载也许可以更长时间地维持干细胞表达成软骨分化标志物。此外，在细胞成软骨分化早期诱导阶段，添加化学诱导剂或采用多轴向力学刺激，均对干细胞定向分化有引导作用。在此基础之上，Zahedmanesh 等[45]发现，联合应力中压缩主应变是MSC成软骨分化最重要的调控者之一，但单轴向压缩力并不足以诱导细胞成软骨分化，仍需在压缩力和剪切力形成的多轴向载荷共同作用下才能实现诱导。相似地，Schätti等[44]也认为在联合应力作用时，软骨相关基因才可以上调，在此过程中剪切力才是关键的一项力学因素。虽然不同学者对于联合应力中的关键应力有着不同观点，但不可否认的是，二者中任何一种应力的缺失都不足以决定干细胞软骨分化命运。

还有一些因素可能会影响多轴向力对MSC成软骨分化的作用，譬如化学诱导剂质量浓度、联合加载力的频率振幅等。Li等[46]发现在联合加载力学刺激14 d后，未添加软骨诱导剂的hMSC组2型胶原、黏多糖等表达明显上调，1 g·L-1低质量浓度TGF-β1诱导组仅有黏多糖表达升高，而10 g·L-1高质量浓度TGF-β1组则会掩饰力学刺激对MSC成软骨分化的促进。同一研究[47]还发现，在7 d天化学诱导和7 d压缩力联合剪切力加载后，加载力频率越高、振幅越大，hMSC成软骨分化相关基因及其蛋白质等表达越高。

2.3 牵张力

研究[48]显示，牵张力是膝关节半月板的主要受力形式，因此探索周期性牵张力学在软骨组织工程中的作用势在必行。Friedl等[49]通过将周期张应力加载于hMSC 3 d后，即检测到软骨分化早期相关分子的表达上调。还有研究[50]发现，不同的牵张力加载周期会对MSC的成软骨分化产生影响：在MSC成软骨分化早期，加载4 d左右相对短时间的周期性张应力，可促进蛋白质和蛋白多糖的合成；当周期性张应力时间延长至12 d时，仅促进蛋白质合成；而更长时间的力学加载则明显促进1型胶原的合成。Baker等[48]将周期性牵张力加载在接种有MSC的纳米纤维支架上，也获得了相似的研究结果。可见，牵张力刺激的作用时间长短，在一定程度上影响着干细胞的成软骨分化过程。

2.4 流体静压力

关节区运动后，因蛋白多糖的锁水作用，关节滑液中的部分水分将储存于软骨基质中，致使软骨组织内的流体静压力升高[35]；但不同流体静压力对MSC成软骨分化的影响不尽相同[51-55]。有学者[52]认为，流体静压力对MSC成软骨基因表达及基质合成几乎没有影响。也有学者[51]对来源不同的猪骨髓MSC长期加载10 MPa、1 Hz以及1 h每天、5 d每周循环流体静压力发现，不同来源组间检测结果不同。他们推测，这一过程存在一定的个体依赖性。有学者[56]则发现，分别加载动态流体静压力和静态流体静压力，前者明显促进MSC成软骨相关基质合成和基因表达，后者则表现为细胞软骨相关基质的丢失。

尽管如此，众多研究者仍对流体静压力对MSC成软骨分化的促进作用给予了肯定。有研究者[53]在无化学诱导的培养体系下，采用7.5 MPa、1 Hz、4 h每天循环流体静压力作用于人脂肪来源的MSC，7 d后试验组中的Sox9、聚集蛋白聚糖、软骨低聚物基质蛋白等成软骨相关分子增多。也有研究者[54]利用特殊的加压装置[56]，通过压力泵调控培养瓶气压以模拟间断动态流体静压力，进行每天12 h间断加力，7 d后的检测数据证实了MSC的成软骨向分化。还有研究[57]不仅证实了流体静压力促进猪MSC的成软骨分化，同时还发现流体静压力与ECM硬度间的相互作用也对细胞分化有影响。ECM的成熟硬化会抑制软骨基质形成和软骨相关基因的表达，外源性流体静压力可以阻断这个过程并抑制其影响，从而维持软骨分化表型。这也进一步说明了内外源性应力在MSC成软骨向分化的过程中存在偶联效应，二者共同作用有利于MSC更高效的成软骨向分化并维持其表型稳定。

3 小结

综上所述，随着组织工程学技术的进步，越来越多的研究者发现力学刺激对MSC成软骨分化有诱导作用，以ECM硬度、ECM形态、ECM密度为代表的内源性应力，以单纯压缩力、压缩力联合剪切力、牵张力、流体静压力等为代表的外源性应力均可在适当的条件下对MSC成软骨向分化有促进作用。既然单纯的内源性应力或外源性应力都难以诱导出达到软骨组织修复要求的软骨组织，那么后续的研究可着眼二者的偶联作用，多条件、多方向对MSC进行成软骨向诱导。相信成功高效诱导高纯度的软骨修复组织指日可待。

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（本文采编 王晴）

Regulation of external and internal forces on the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells

Qiu Jingyi, Wan Lingyun, Zhao Zhihe, Li Juan. (State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

This study was supported by National Natural Science Foundation of China(31470904, 31370992) and Sichuan Province Science and Technology Support Project(2014SZ0019).

With advancements in tissue engineering, therapies for osteoarthritis have been developed. Mesenchymal stem cells(MSC) can differentiate into various cell types and be used as an optimum source of cells for tissue engineering to produce an engineered cartilage. However, the efficient and stable stimulation of chondrogenetic differentiation of MSC is a key challenge in cartilage tissue engineering. Further studies have been conducted to investigate mechanical stimulation and to determine the internal and external forces that can stimulate the chondrogenic differentiation of MSC and maintain their phenotypes. This review summarizes the research progress on the effects of internal and external forces on the chondrogenic differentiation of MSC.

mesenchymal stem cell； mechanical stimulation； mechanotransduction； stem cell differentiation；chondrogenesis

Q 256

A

10.7518/gjkq.2016.04.017

2015-12-03；

2016-03-28

国家自然科学基金（31470904，31370992）；四川省科技支撑计划（2014SZ0019）

邱静怡，硕士，Email：Solaqiu@foxmail.com

赵志河，教授，博士，Email：zhzhao@scu.edu.cn 持续、有效的软骨修复尚无报道[2]。间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源于胚胎发育的中胚层，具有多向分化潜能和自我更新能力。MSC除了来自于骨髓之外，在脂肪、滑膜、胎盘、肝、肺、脾和胰腺等组织器官均可获得此种细胞[3-7]。MSC来源的多元性也为专向诱导其成脂向分化、成肌向分化、成骨向分化和成软骨向分化提供了生物学基础。MSC取材容易、遗传背景稳定、体内植入反应弱、有多向分化潜能、与支架材料生物相容性优成为了构建工程化软骨最理想的种子细胞[8]。