鸡心包积水综合征疫苗研究进展

程小果，王 慧，程 宁，陈申秒，朱 杰，宿春虎，郭建友，张小荣，吴艳涛

(1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东滨州 256606；2.山东畜牧兽医专科学校，山东潍坊 261061；3.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009 )



鸡心包积水综合征疫苗研究进展

程小果1△，王 慧1△，程 宁2，陈申秒1*，朱 杰1，宿春虎1，郭建友1，张小荣3，吴艳涛3

(1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东滨州 256606；2.山东畜牧兽医专科学校，山东潍坊 261061；3.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009 )

心包积水综合征是由I亚群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起的一种新型鸡传染病。本病发病急，传播速度快，造成雏鸡的高死亡率，给养鸡业造成严重的经济损失。该病于1987年在巴基斯坦靠近卡拉奇的安卡拉首先被报道，我国最早于2013年有发病报道，2014年后在河南、山东、江苏等地流行。针对本病目前无特效疗法，疫苗免疫是防控本病的较好方法。在巴基斯坦等心包积水综合征早先流行比较严重的国家和地区，研制的自家疫苗对预防本病有一定效果，但是也存在保护效果不稳定、继发感染等风险；全病毒灭活疫苗安全性高，稳定性好，但成本较高。此外，活疫苗也展现出较好的防控效果，但存在毒力返强等问题，重组亚单位疫苗则因其安全、高效在未来具有良好的开发和应用前景。论文就鸡心包积水综合征疫苗的研究进展加以总结，以期为更好的防控本病提供参考。

心包积水综合征；禽腺病毒C种血清4型；安卡拉病；疫苗

心包积水综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)是由腺病毒科禽腺病毒属(I亚群禽腺病毒)禽腺病毒C种血清4型(Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)引起的一种新型家禽疫病[1]，其典型症状是3周龄～5周龄雏鸡突然死亡，伴发心包积水及包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)等典型病变。该病于1987年在巴基斯坦靠近卡拉奇的安卡拉首先被报道，因此又称安卡拉病(Angara disease，AD)[2]，1989年在墨西哥，其后在印度、伊拉克、秘鲁、厄瓜多尔、智利、中南美洲、俄罗斯和孟加拉国等其他国家或地区也相继发现该病。我国最早于2013年有报道发现此类病例[3]，2014年之后，该病在河南、山东、安徽、江苏等养鸡较密集的省份和地区呈地方性流行[4-6]。FAdV-4主要引起肉鸡及育雏、育成期蛋鸡发病。本病发病急，传播速度快，造成雏鸡的高死亡率，给养鸡业造成严重的经济损失。本病主要发生于3周龄～5周龄的肉鸡，肉杂鸡、麻鸡、种鸡和蛋鸡亦可在相似的日龄段发病，死亡率在10%～40%甚至更高，一般在30%左右。急性发病死亡病例临床症状不典型，个别鸡会出现拉稀，排黄绿色稀粪，鸡群发病后很快到达死亡高峰，维持1周～2周后病死率逐渐下降[6]。

目前对本病尚无特效疗法，国内尚无商品化疫苗防控FAdV-4的感染。在巴基斯坦等早先FAdV-4感染流行比较严重的国家和地区，研制的自家苗用于预防本病获得了成功[7]，国内也有相关学者报道用当地流行的FAdV血清型分离株制备灭活苗。本文就HPS疫苗的研究进展进行概述，以期为本病的更好防控提供参考。

1 灭活疫苗

灭活疫苗较活疫苗安全，在激发机体的体液免疫方面具有优势。按照制备工艺不同，灭活疫苗可分为组织灭活疫苗和全病毒灭活疫苗两大类。

1.1 组织灭活疫苗

Ahmad I等[8]收集自然感染HPS肉鸡的肝脏，用5 mL/L或1 mL/L的甲醛或1 mL/L的β-丙内酯(BPL)灭活制备灭活疫苗，1 mL/L甲醛或1 mL/L BPL制备的疫苗可以对试验攻毒鸡提供保护；临床试验结果显示，免疫灭活疫苗组的死亡率在试验1组和2组分别为0.77%和3.8%，而非免疫组则分别为11.10%和30%；15日龄～18日龄单次免疫较10日龄～12日龄单次免疫对防控35日龄～40日龄段本病的高发效果更好。Afzal M等[9]用研制的甲醛灭活人工感染鸡肝脏组织灭活疫苗免疫一次后，免疫鸡群的死亡率为0.52%，与非免疫鸡群5.34%的死亡率比较，显示出较好的预防效果；在已感染的鸡群使用时，免疫鸡群的死亡率为2.33%，也明显比非免疫鸡群10.27%的死亡率要低的多，故可紧急免疫使用。

Ahmad K等[10]证实用甲醛灭活HPS病变典型的鸡肝组织匀浆液而获得的组织苗对于控制HPS有效。尽管肝组织含量分别为10%、7.5%和5%的疫苗之间效果无明显差异，但却较2.5%和1%的明显要好；肝组织含量分别为10%和7.5%的疫苗免疫均可降低死亡率，但肝组织含量5%的疫苗在提供保护和经济性方面最好，没有广泛流行地区的鸡群也需要免疫疫苗。临床使用的疫苗的标准不同，因此还需时常对疫苗效果进行评估。Khan S A等[11]对市售的4种HPS油乳剂灭活疫苗进行了无菌、安全、效力及纯度等方面的盲检，发现这些疫苗均无菌、纯净且安全，但均存在免疫原性不足及不能提供100%保护的缺点。当免疫后攻毒剂量为2倍的半数致死量时，虽然试验鸡均未出现死亡，但在剖检的免疫组及对照组鸡的心、肝、肾均发现了病变，并且在肝细胞内出现明显的包涵体。因此，现有的市售疫苗对控制HPS效果较差。Mehmood M D等[12]证实，在免疫过当地HPS病死鸡肝匀浆(HPS-LH)疫苗的肉鸡中，HPS的发病仍常见。在HPS-LH疫苗生产的过程中，很多因素如抗原来源及其含量、佐剂类型等均会影响疫苗的免疫效果。经试验证实，HPS-LH油乳剂疫苗保护效果明显较铝胶佐剂的效果要好，鸡胚肝细胞匀浆(CEHH)疫苗的抗原含量较HPS-LH要低很多。同样是铝胶佐剂，HPS-LH疫苗的保护率(≥90%)也较HPS-CEHH疫苗的保护率(约40%)明显要好。

组织灭活疫苗是较早研发且投入到临床使用的一类HPS疫苗，因免疫保护效果确实，制备方便快捷，针对突发疫情可作出快速应对而在一些国家和地区被广泛采用。但这类疫苗存在两个缺点：首先，它们一般是利用从不同地区感染不同病毒导致临床表现HPS鸡群获取的肝组织经研磨粉碎之后所制备，鸡群感染的严重程度、生长环境及实验室条件等均不一致，会导致不同批次疫苗的病毒滴度不同，疫苗激发的免疫反应相应的也会不一致且不可预测，因此保护效果并不稳定；其次，由于使用的是匀浆肝组织，继发细菌感染或其他病毒感染的风险会很大。

1.2 全病毒灭活疫苗

从HPS发病鸡群可分离得到FAdV，通过对FAdV分离株相关免疫原性等方面进行鉴定可筛选获得适合制备全病毒灭活疫苗的优势毒株。配以白油作为免疫佐剂乳化后即得到油乳剂灭活苗，并可对其安全性、免疫效力等方面进行评估，以确定制备的疫苗产品的效果好坏及其是否具有推广价值。

Kim M S等[13]研制了FAdV-4型油乳剂灭活疫苗，并通过免疫攻毒试验证实，不仅对免疫过的鸡群，而且对免疫种鸡的子代鸡的FAdV分离株感染也均提供较好的交叉保护；FAdV-4型油乳剂灭活疫苗可对多种血清型FAdV以及FAdV-4提供广泛的交叉保护，是有效控制各种血清型FAdV病毒水平或垂直传播的疫苗产品。韦悠等[14]以I群FAdV- 4及血清8型(FAdV-8)的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗，比较甲醛及BPL的灭活效果并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验。结果以1.00 mL/ L终浓度的甲醛或0.50 mL/L终浓度的BPL灭活为宜；免疫攻毒保护试验结果显示，疫苗的保护率可达100%，能完全抵抗病毒攻击。田间试验结果表明，在免疫初期疫苗抗体可达到预期免疫效果，免疫保护期在6个月以上，在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数。该双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好，为净化I群禽腺病毒提供了技术支撑。

上述报道证实FAdV-4灭活油乳剂疫苗防控HPS的效果较好。该类疫苗具有安全性高，稳定性好，能长期保存和运输，且使用简便，接种程序相对简单，可降低应激反应等优点，较组织灭活苗更适用于大规模生产。

2 活疫苗

HPS活疫苗系将FAdV流行株适应鸡胚或某些细胞系后，通过培养传代的方法使其毒力减弱而制备成的疫苗。相比较早期的肝组织甲醛灭活疫苗，HPS活疫苗免疫鸡群的存活率更高，内脏器官的病变损伤率更低。

将FAdV-4在试验条件下感染SPF鸡后，可导致淋巴器官中B细胞和T细胞的衰竭，从而造成免疫抑制[15]。将FAdV-4强毒株通过成纤维细胞系QT35和鸡胚肝细胞(CEL)进行培养适应后，进行人工毒力致弱。1日龄SPF雏鸡感染致弱毒株FAdV-4/QT35后未表现临床症状及死亡，而经肌肉注射CEL适应毒FAdV-4/CEL的21日龄SPF鸡则死亡率很高[16]。Mansoor M K等[17]通过在鸡胚上盲传4代后得到一株鸡胚适应毒，并通过连续传代12次而将其致弱得到一弱毒活疫苗株。通过与市售商品化肝组织甲醛灭活疫苗免疫攻毒对比试验发现，弱毒苗较市售灭活疫苗对免疫攻毒鸡只可提供更好的保护，试验鸡存活率更高，内脏如肝脏和心脏的病变损伤率更小，可以做为控制该病的候选疫苗。

鉴于对疫苗安全性及生物安全的不断加强，活疫苗因其毒力返强和毒力偏强等原因在生产应用及临床推广中受到限制。因此，有必要开发安全性更高，且免疫保护效果更优的疫苗。

3 亚单位疫苗

在一些HPS流行国家和地区，虽然活疫苗、灭活疫苗等对HPS起到了一定的防控效果，但这些常规疫苗也展现出了不完全弱化或灭活不完全，毒力返强，潜在致癌及基因不稳定，继发细菌感染或其他病毒感染的风险会增大，不利于生物安全等问题，因此有必要研制一些新型疫苗。

FAdV-4病毒粒子直径70 nm～90 nm，无囊膜，呈20面体对称结构，具有12个五邻体(penton)和240个六邻体(hexon)[1]，FAdV-4的关键感染能力是外部的壳蛋白或衣壳蛋白。六邻体作为主要结构蛋白，组成了衣壳的主体。病毒感染主要由五邻体和纤丝蛋白介导，纤丝还与细胞受体结合及病毒的组织嗜性密切相关。20面体的每个顶点覆盖着五邻体和从其基部突起的纤丝，FAdV-4有2个独特的纤丝蛋白，即纤丝-1和纤丝-2，而其他大部分禽腺病毒均为1个[18]，纤丝-1基因为高编码潜力基因[19]。Asthana M等[20]报道亚单位疫苗较传统的组织灭活苗、病毒灭活疫苗和活疫苗有明显优势，随着对基因工程亚单位疫苗研究的相关免疫学数据的不断积累，可大大减少筛选潜在表位蛋白的时间。

Shah M S等[21]将大肠埃希菌原核表达HPS病毒的五邻体核衣壳蛋白制成亚单位疫苗用于免疫肉鸡。免疫原性测定和强毒攻毒保护试验证实该疫苗保护率达90%以上，重组五邻体核衣壳蛋白亚单位疫苗可以作为预防HPS的备选疫苗。Schachner等将3个不同的FAdV-4衣壳蛋白，即纤丝蛋白-1、纤丝蛋白-2和六邻体环-1通过杆状病毒表达系统真核表达，并对其诱导鸡群产生的保护力进行检测。分别对相互隔离的1日龄SPF鸡免疫纯化后的3种重组蛋白，并于免疫后21 d用高致病力FAdV-4株攻毒。另设2个对照组，一个攻毒对照组，不免疫但用FAdV-4株攻毒；一个空白对照组，均用PBS免疫和攻毒。免疫纤丝蛋白-2组的鸡表现出很好的保护力，攻毒后只有1只鸡死亡(1/28)，而攻毒对照组的死亡率达78%。免疫纤丝蛋白-1组的死亡率为38%，表现为中等保护力；而六邻体环-1免疫组的死亡率达73%，不能提供有效保护。尽管免疫印迹试验证实所有免疫组的鸡均有特异性抗体存在，但是这些特异性抗体并没有中和活性。因此，重组纤丝蛋白-2为FAdV-4的重要保护性免疫原，所制备得亚单位疫苗具有良好的开发和应用前景[22]。

与活疫苗和灭活苗这些常规疫苗相比，亚单位疫苗是一类新型疫苗。有研究通过制备相关亚单位疫苗且通过试验验证其安全可靠，因此基因工程亚单位疫苗将成为未来HPS疫苗的重要发展方向。且一些非致病性FAdV-4自身即可作为基因工程重组疫苗的候选载体，可用于表达其他病毒的某些抗原基因[23]。

4 小结与展望

4.1 FAdV-4株是HPS的主要病因

大多数I亚群禽腺病毒对鸡的致病作用还未完全确定，FAdV-4株是HPS的主要病因。Choi K S等[24]2007年-2010年，调查了39例禽腺病毒感染的临床病例,其中所有的FAdV-4型病例均表现出HPS及IBH的临床病变；FAdV-8b和11型病例则表现为IBH，而无HPS病变。Kim J N等[25]从韩国表现HPS的肉鸡、蛋鸡、种鸡及土鸡病例中分离得到几株禽腺病毒也为FAdV-4毒株。而Zhao等在中国境内分离到3株FAdV，其中2株为FAdV-11型，1株为FAdV-4型，分离株HBQ12和JSJ13分别为FAdV-11和FAdV-4，但均可引起试验感染鸡出现IBH和HPS病变，这也是第一个报道非FAdV-4型I群禽腺病毒口服感染可引起试验鸡出现HPS病变的毒株[3]；Rahul S等[26]从印度不同地区分离到8株FAdV，通过病毒中和试验以及PCR-RFLF对其进行了血清型分析，6株属于FAdV-4，1株属于FAdV-12，而另外1株则同属于FAdV-4和FAdV-12，证实FAdV-12可单独或联合FAdV-4造成印度国内鸡群的HPS。Mase M等[27]对比来自日本、印度和巴基斯坦引起鸡群HPS的FAdV-4分离株的短纤丝蛋白基因的序列，并通过全基因组序列遗传进化分析发现，不引起HPS的FAdV-4分离株组成一个新的分支，并通过PCR-RFLP分析短纤丝蛋白基因发现，引起HPS的FAdV-4分离株与上述这个分支明显不同。

4.2 做好HPS的流行病学调查工作

Mittal D等[28]对印度33个禽腺病毒分离株通过PCR-RFLP分析发现，引起印度肉鸡IBH或HPS的禽腺病毒的型号非常多，有7个血清型，且有相当比例(12/33)的病例是两种禽腺病毒混合感染造成的；目前国内一些省份和地区流行的FAdV血清型众多且存在差异[29]，从而增大了防控难度。因此，为了按照“早、快、严、小”原则更好的防控HPS在我国的传播与流行，需做好该病的流行病学调查工作，并据此制定合理的免疫和防控方案，尽快控制本病并逐步将其消灭。

4.3 制定综合方案来防控HPS

Choi K S等[24]调查了39例禽腺病毒感染的临床病例，其中51.3%病例存在IBDV和CIAV的并发，所有的土鸡病例中均存在CIAV。因此，在养鸡场需采用抗FAdV感染和免疫抑制性疾病的预防控制措施。Toro H等[30]通过试验证实，种鸡免疫FAdV-4和鸡白血病就可以对子代雏鸡防控HPS提供有效保护，而FAdV单独免疫组则显示出较差的保护效果。因此，需结合本病的流行特征和发病规律等制定综合防控方案，注重生物安全的同时，加强饲养管理，并注重对协同致病因素如IBDV、CIAV的防控，从而更好的防控HPS的传播与流行[6]。

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Progress on Hydropericardium Syndrome Vaccine

CHENG Xiao-guo1，WANG Hui1，CHENG Ning2，CHEN Shen-miao1， ZHU Jie1，SU Chun-hu1，GUO Jian-you1，ZHANG Xiao-rong3，WU Yan-tao3

(1.ShandongBinzhouWohuaBiotechCo.,Ltd，Binzhou，Shandong，256606，China； 2.ShandongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege，Weifang，Shandong，261061，China； 3.CollegeofVerterinaryMedicine,YangzhouUniversity，Yangzhou，Jiangsu，225009，China)

Hydropericardium syndrome(HPS) is a newly occurred chicken disease caused by Fowl adenovirus serotype-4(FAdV-4).The disease has caused huge economic losses to the poultry industry since it′s fast spread and high mortality rate.HPS was reported first time in 1987 at Angara goth, a broiler producing area near Karachi Metropolitan city of Pakistan.It was firstly reported in China in 2013,and then spread widely in Henan, Shandong, Jiangsu and other provinces.Besides vaccination,there were no effective therapies for this disease.Formalinized aqua based liver organ vaccines for HPS were effective for the control of the disease in Pakistan and other epidemic countries and regions,which has obvious deficiencies such as unstable efficiency and greater risk of secondary infection.Inactivated FAdV-4 virus vaccines were safe and stable but the costs were much higher.In addition,live vaccines also have provided quite effective protection while the drawbacks were virulence return.Recombinant protein vaccines take a good development and application prospects in the future since their safety and efficiency.The progress on the study of HPS vaccines was summarized in this paper in order to find the proper vaccines and methods for controlling HPS in the future.

Hydropericardium syndrome；FAdV-4;angara disease；vaccine

2016-05-12

程小果(1985-)，男，山东泰安人，硕士，主要从事家禽传染病的防控研究； 王 慧(1986-)，女，山东济南人，硕士，主要从事畜禽传染病的防控研究。△同等贡献作者*通讯作者

S852.4

A

1007-5038(2016)11-0097-05