梅毒免疫和梅毒螺旋体的研究进展

刘宏业 韩燕 尹跃平

梅毒免疫和梅毒螺旋体的研究进展

刘宏业 韩燕 尹跃平

梅毒螺旋体有着独特的基因和蛋白结构，对其基因分型有利于梅毒分子流行病学的研究。梅毒螺旋体缺乏脂多糖与外膜蛋白，但可表达多种脂蛋白，这些脂蛋白同梅毒螺旋体的组织黏附及播散有关，同时可诱导机体发生免疫应答。机体对于梅毒螺旋体的免疫应答过程十分复杂，固有免疫、体液免疫及细胞免疫均在梅毒螺旋体的感染过程中参与了应答过程。Th1型细胞免疫在梅毒的发生发展过程中起重要作用，梅毒患者在局部及系统免疫方面都存在细胞免疫的异常。

梅毒；苍白密螺旋体；免疫；抗原；Th1细胞

梅毒是梅毒螺旋体（Tp）所引起的一种性传播疾病。临床表现复杂，几乎可侵犯全身各器官，也可通过胎盘引起流产、早产、死产及胎传梅毒，或者长期潜伏，可增加人免疫缺陷病毒（HIV）感染的风险［1］。Tp由德国学者Schaudinn和Hoffmann于1905年在梅毒患者的初疮中首先发现，尽管多年来应用青霉素治疗梅毒取得了良好的疗效，但由于Tp在体外不易生存，且无法体外稳定培养，限制了深入研究。随着分子生物学、免疫学的不断发展，人们对梅毒螺旋体及梅毒免疫的认识进入了一个新的阶段。

1 Tp基因组和基因分型

随着Tp（Nichol株）基因组的测序完成，人们对Tp有了更进一步的认识。Tp基因组是由1 138 006 bp组成的环状染色体，包含1 041个开放阅读框。与可培养菌相比，Tp缺乏三羧酸循环、电子传递体系，以及核苷酸、氨基酸、脂质生物合成途径，但其基因组可编码多种转运蛋白，说明生存绝对依赖宿主。为了研究梅毒的感染网络，以及耐药株的传播和筛选，目前较多应用酸性重复蛋白（acidic repeat protein，arp）基因、重复蛋白（treponema pallidum repeats，tpr）基因TprEGJ和tp0548基因对Tp进行基因分型。即将arp基因含有的60 bp重复序列的数目和TprEGJ限制性片段长度多态性以及tp0548基因131⁃215 bp序列的不同变异组合成一个Tp基因型别。Tp的基因分型为Tp分子流行病学的研究提供了基础，对于探讨Tp基因型别、毒力、所致梅毒临床类型及转归、耐药性之间的关系具有重要的价值［2⁃4］。

2 Tp抗原

尽管Nichol株全基因测序已经完成，但对Tp外膜蛋白的研究尚缺乏突破性进展。首先Tp外膜十分脆弱，极易被破坏；其次，目前方法学上很难将外膜蛋白与周质蛋白鉴别开来；第三，除Tp0326/Tp92外，Tp基因组不编码与已知G-菌外膜蛋白的同源产物。加之现有检测方法敏感性的不足都限制了对外膜蛋白的研究。目前研究认为，Tp与G-菌不同，其外膜缺乏脂多糖，仅有为数不多的外膜蛋白，因而被称为“隐匿的病原体”［5］。有研究表明，Tp的主要膜免疫原是亲水性多肽（脂蛋白），在胞质膜周质小叶上的氨基酸末端脂质以共价键结合，这是一种使其难以和高滴度的特异性抗体相互作用的拓扑结构［6］。尽管Tp仅含有少量完整的外膜蛋白，但是利用生物信息学方法推测包括12种Tpr在内的一些候选蛋白［7］。所有Tpr蛋白中对TprK研究最为深入，一方面TprK可诱导出强烈的体液和细胞免疫，利用重组TprK免疫后产生针对Tp感染的部分免疫；另一方面，TprK的多样性被认为与Tp的免疫逃逸密切相关。研究发现，TprK的多样性存在于不同菌株之间以及同一菌株之内，可能使Tp逃逸抗体的调理吞噬作用，导致慢性潜伏感染的发生［8⁃10］。然而也有研究认为，TprK不在膜表面表达，而是位于周质，不能诱导保护性免疫的发生［7］。其他一些膜蛋白可能参与了Tp与组织的黏附和播散，如Tp0136可与细胞及血浆中的纤连蛋白结合［11］。Tp0751能够结合层粘连蛋白和纤维蛋白原，并通过其锌离子依赖的蛋白酶降解层粘连蛋白［12］。Tp0750可通过基质金属蛋白酶样的水解作用降解细胞外基质，可通过抑制血栓形成和促进纤溶两方面的作用来降解使感染局限的血栓［13］。近年来，应用基因工程技术构建的重组Tp蛋白为Tp膜蛋白的研究提供了新的方法，有学者利用人脐静脉内皮细胞对不同的Tp重组蛋白研究发现，Tpp17、Tpp47可活化HUVEC，并提高人脐静脉内皮细胞对THP⁃1细胞的趋化和黏附能力［14⁃15］。Tp0956能够激活内皮细胞并增加内皮细胞屏障的渗透性［16］。Tp膜蛋白在Tp感染过程中起了重要作用，并且是机体免疫识别，诱导免疫应答的重要靶点。

3 机体对Tp的免疫应答

3.1 固有免疫：不仅是机体对抗微生物感染的重要屏障，也是适应性免疫建立的基础。Silver等［17］通过构建Tp感染的小鼠模型研究发现，MyD88（一种大多数TLR信号转导途径中的主要接头蛋白）缺陷小鼠感染的Tp载量明显高于野生小鼠，而且出现更明显的炎症反应。另有研究发现，梅毒患者皮损和外周血中有活化的自然杀伤细胞，尤其是皮损处CD56+的自然杀伤细胞显著增高，说明自然杀伤细胞在 Tp 感染中也起到作用［18⁃19］。完整的 Tp 或TpN47能诱导内皮细胞表达黏附分子细胞间黏附分子1，血管内皮细胞黏附分子1和E选择素；TpN47还能与巨噬细胞、树突细胞表面CD14相结合，并通过TRL1/TLR2异二聚体转导活化信号激活巨噬细胞和树突细胞。在树突细胞培养过程中观察到，Tp与树突细胞相互作用后可被未成熟的树突细胞吞噬，并使未成熟的树突细胞开始表达成熟标记CD54、CD83及主要组织相容性复合体Ⅱ。随着树突细胞的成熟，开始产生IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃12、TNF⁃α、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白1α和1β对Tp产生应答，而炎症细胞因子又进一步扩大了内皮细胞的活化及炎症细胞的浸润。巨噬细胞、树突细胞、内皮细胞等抗原提呈细胞的活化和炎症细胞因子的产生，促进了适应性免疫应答的建立［20］。

3.2 体液免疫：人对Tp无先天免疫力，仅在感染后才产生感染后免疫。抗体的检测对于梅毒的筛查和诊断十分重要。Tp感染机体后能产生多种抗体，可分为两大类：抗心磷脂抗体和抗螺旋体抗体。目前临床上广泛开展的梅毒血清学试验正是基于对这两类抗体的检测。近年来，利用重组Tp蛋白检测抗Tp的IgM、IgG抗体的一些新方法已经发展，如梅毒快速诊断试验（rapid point⁃of⁃care tests）、酶免疫分析（EIA）和化学发光法（CIA）等。这些方法特异性和敏感性均高，且易于自动化操作，但这些方法均检测血清中特异性梅毒螺旋体抗体，因此，无法鉴别Tp感染的时间点及是否经过治疗。另外，EIA/CIA可能出现假阳性，因此对于EIA/CIA阳性的标本需做梅毒螺旋体血球凝集试验或梅毒螺旋体明胶凝集试验以及另一种非梅毒螺旋体抗原血清学试验复检，以排除是否为假阳性并确证是否为Tp的现症感染［21］。近年来不少学者通过对重组Tp蛋白的研究，已经发现了一些抗原（如Tp0453、TpF1等）具有较强的免疫原性，在感染过程中能产生特异的高效价抗体，并与其他螺旋体感染不发生交叉反应［22⁃23］。这些抗原有望为梅毒的实验室检测提供新方法，并为疫苗的研发提供新的靶点。体液免疫在Tp感染过程中可产生具有调理作用的抗体，可在补体介导下发挥制动和中和作用，使巨噬细胞通过IgG、IgM调理吞噬清除感染部位的Tp。然而在Tp感染的家兔模型中，尽管出现了功能性抗体，但免疫血清被动免疫接种试验却未出现抗Tp感染的保护性免疫。这表明针对Tp的体液免疫是不全免疫，不能完全清除Tp，从而需要细胞免疫的共同参与［24］。

3.3 细胞免疫：目前认为，与体液免疫相比，在抗Tp免疫方面，细胞免疫发挥更为重要的作用。对家兔模型的研究发现，接种1 d后局部感染Tp的数量迅速上升，第10天时达到峰值。接种初期血管周围首先出现少量多形核白细胞浸润，第4天起出现IL⁃2，随后出现T细胞增殖、浸润，自第6天时活化的T细胞产生IFN⁃γ，到10 d时达到峰值，与此同时，感染部位出现巨噬细胞浸润吞噬清除Tp。从第10天开始，伴随巨噬细胞浸润数量增多，接种部位Tp数量迅速减少［25］。这种通过Th1介导的迟发型变态反应大量活化的巨噬细胞在Tp的清除、下疳愈合方面起作用。尽管这种以Th1型为主“清除性免疫”十分有效，但其作用却不足够，因为部分Tp能抵抗巨噬细胞的吞噬作用，播散到远隔部位，引起二期梅毒。Tp的免疫逃逸机制目前尚不十分清楚，可能的机制包括表面抗原的缺乏，Tpr的变异以及早期播散到免疫豁免部位（如中枢神经系统）等［5，8，26］。随着病程的发展，细胞免疫会发生由Th1向Th2的漂移，至二期梅毒时转为Th2型为主［27］。除了Th细胞的漂移，还发现梅毒患者存在CD4+/CD8+T、Th17/Treg的比例失衡。研究发现，二期梅毒患者外周血中CD4+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值降低而CD8+T细胞计数高于正常对照组［19］。Th17和Th22的表达水平高于正常人［28］。CD4+CD25+调节性T细胞明显高于正常对照组［29］。血清固定患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞明显高于正常对照组［30］。这些研究结果表明，无论是皮损局部，还是外周血中都存在着细胞免疫的异常，这可能是Tp与机体相互作用的结果，而细胞免疫的异常则可能是导致Tp长期慢性感染的原因。

4 结语

梅毒仍然是世界范围内严重的公共卫生问题。Tp作为病原体，其特殊的基因组和蛋白结构对研究工作提出了很大的挑战。人们虽然在Tp的基因、膜蛋白以及感染的免疫应答等方面的研究取得了一定的进展，但在其致病因素、机体的免疫应答、以及免疫逃逸等方面尚待进一步研究。

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Immune response in syphilis and Treponema pallidum

Liu Hongye,Han yan,Yin Yueping.Reference Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

Treponema pallidum（Tp）has unique genome and protein structures.Tp genotyping may facilitate molecular epidemiological studies of syphilis.Tp lacks lipopolysaccharides and outer membrane proteins,but can express various lipoproteins,which are associated with tissue adhesion and dissemination of Tp,and can induce the host immune response.The host immune response to Tp is a very complex process with the involvement of innate immunity,humoral immunity and cellular immunity.T helper type 1 cell immunity plays an important role in the occurrence and development of syphilis.Both local and systemic cellular immunity are abnormal in patients with syphilis.

Syphilis;Treponema pallidum;Immunity;Antigens;Th1 cells

10.3760/cma.j.issn.1673⁃4173.2016.06.017

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所参比实验室

尹跃平，Email:yinyp@ncstdlc.org

2015⁃11⁃12）