炎性体NLRP3及其在肝损伤中的作用

100853　北京　解放军医学院(臧红)；解放军第三○二医院(臧红，沈宏辉，辛绍杰)



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炎性体NLRP3及其在肝损伤中的作用

臧红沈宏辉辛绍杰

100853北京解放军医学院(臧红)；解放军第三○二医院(臧红，沈宏辉，辛绍杰)

炎性体(inflammasome)是新近发现的一类位于胞内的多蛋白复合体，参与人体的炎症和免疫反应，和遗传代谢病、糖尿病、动脉粥样硬化、肠道炎症、肿瘤以及肝病等多种疾病的发生发展有关，炎性体相关疾病的分子机制等研究逐渐成为国际热点[1-4]。

炎性体的核心成分为核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors，NLRs)家族蛋白或PYHIN家族蛋白，主要包括NLRs家族的NLRC4、NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP12和PYHIN家族的AIM2、IFI16。炎性体激活炎症反应，调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 (cysteiny aspartate-specific protease，Caspase-1)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的解离和活化，进而导致复杂的细胞反应网络，启动局部和全身炎症反应[5]。NLRP3炎性体是目前研究最为充分的炎性体，与多种疾病有关。NLRP3炎性体由NOD样受体NLRP3，接头分子ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)及效应分子procaspase-1组成。NLRP3是这一大分子复合体中的关键组成部分，并激发caspase-1依赖性细胞因子IL-1β、IL-18前体细胞成熟[6]。

一、NLRP3炎性体的激活

NLRP3主要表达于树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等免疫细胞[7]。在原代培养的肝细胞几乎不表达NLRP3，体外应用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激肝细胞可引起NLRP3强表达[8]。正常情况下NLRP3与热休克蛋白90等分子伴侣结合在一起，处于自我抑制状态。NLRP3炎性体通过细胞内的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和危险相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)在炎症和天然免疫反应过程中发挥作用，当受到PAMPs或DAMPs刺激后NLRP3募集ASC，通过ASC与procaspase-1结合组装成炎性体。炎性体可以将无活性的procaspase-1转化为有活性的caspase-1，活性caspase-1分子不仅可以将IL-1β前体(pro-IL-1β)和IL-18前体(pro-IL-18)转化为有活性的IL-1β和IL-18分子发挥生物学作用，而且可以介导炎症型细胞死亡(pyroptosis)[9]。NLRP3炎性体激活分2步：首先是位于细胞膜的Toll样受体(toll-like receptor，TLR)激活后通过核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)促进胞内NLRP3炎性体各分子转录和翻译，然后在炎性体激活剂的作用下激活NLRP3炎性体[7]。

NLRP3炎性体激活的具体分子机制尚未完全明确，NLRP3炎性体可被多种刺激物激活的特点，使NLRP3成为功能最为复杂也是最为重要的炎性体，但目前我们对NLRP3的活化仍知之甚少[10]。目前认为与细胞内钾离子外流、胞浆内cAMP减少和钙离子浓度升高、溶酶体损伤、产生活性氧(ROS)等有关[11,12]。NLRP3炎性体能够被多种物理和化学因子激活。其中有外源性微生物刺激物，包括LPS，脂寡糖，核酸，胞壁酰二肽(MDP)，某些穿孔毒素如肺炎球菌溶血素，刺尾鱼毒素等；环境大分子无机晶体结构，如石棉、二氧化硅等；内源性信号如细胞内ATP、尿酸晶体、透明质酸和硫酸肝素、可溶性β原纤维等[7]。NLRP3炎性体也可被坏死细胞但非凋亡细胞激活，释放IL-1β和IL-18，引起所谓的无菌性炎症反应[13]。NLRP3炎性体激活后促进免疫细胞产生效应分子IL-1β和IL-18，IL-1β、IL-18和受体结合后触发一系列信号通路，激活单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α等多种促炎细胞因子、黏附分子和趋化因子，募集炎症细胞，在炎症和天然免疫反应中发挥作用[14]。

上述大量不同的NLRP3活化因子，并非每一个因子都能直接与炎性体结合，所以有人提出，炎性体的激活可能存在共同的分子或通路。研究表明有三条可能的通路：第一个假设的通路是ROS，认为ROS是NLRP3炎性体激活的近端信号。ROS是古老且高度保守的危险信号，在许多经过检测的NLRP3活化因子处理后观察到ROS产物升高[15]。第二条通路是细胞内钾离子浓度下降，通过内源性离子通道或细菌穿孔毒素，造成炎性体激活。根据这两个假设，隔离NLRP3活化因子引起的ROS或阻滞NLRP3活化因子引起的K+流出，可抑制NLRP3激活，减少caspase-1的活化和IL-1β的形成[16]。第三个假设是由于吞噬微粒或活的病原导致溶酶体膜破坏，造成NLRP3活化分子进入细胞溶质，很可能是组织蛋白酶B或组织蛋白酶修饰的蛋白[17]。Shimada等[18]提出了一个将三种NLRP活化可能机制统一的理论：细胞内K+离子外流、溶酶体膜破坏和ROS信号共同导致氧化线粒体DNA而后激活NLRP3炎性体。

二、NLRP3炎性体的负调控

炎性体信号通路与其他信号通路之间存在密切联系，炎性体的激活受到严密、精确的调控。目前宿主对炎性体负调控机制主要包括：含有PYCARD结合域的蛋白分子能够在一定程度上竞争炎性体中心PYCARD区，从而抑制信号传递[19]； TRIM 30(tripartitemotif protein)通过降解TLR信号通路中的TAB2/TAB3来负性调控NF-κB的活化[20]；也有研究表明细胞内cAMP水平升高可导致NLRP3抑制[21]，微小RNA miR-223能够特异靶向于NLRP3 mRNA的3’UTR区，从而抑制NLRP3 mRNA的表达[22]。此外I型干扰素可以调控NLRP3炎性体活性，IFN-β可诱导内源性一氧化氮(NO)，NO能够对NLRP3分子进行硫醇亚硝基化修饰抑制其募集ASC，从而抑制NLRP3炎性体的激活[23]。下调NLRP3炎性体激活的另一机制是通过特异性免疫系统的作用，2009年Guarda等[24]研究发现，小鼠CD4+效应性和记忆性T细胞能够以细胞-细胞接触的方式抑制NLRP1、NLRP3炎性体介导的caspase-1活化和IL-1β成熟，而受体-配体结合的方式可以取代这种细胞-细胞相接触的抑制方式，活化的T细胞表面表达的肿瘤坏死因子家族配体如CD40配体(CD40 ligand，CD40L/CD154)与受体CD40结合时，可抑制巨噬细胞NLRP3炎性体的激活，减少IL-1β和IL-18分泌，这种抑制由P2X7R介导，但CD4+T细胞对非P2X7R介导的NLRP3炎性体的激活并未表现出明显的抑制作用。单独的CD40L也能抑制明矾等激活剂导致的巨噬细胞NLRP3炎性体激活、caspase-1活化和IL-1β分泌。总之，NLRP3炎性体的调控极其复杂。

三、NLRP3炎性体与肝损伤

越来越多的研究显示，NLRP3炎性体与肝损伤有密切关系。正常肝组织低表达NLRP3，四氯化碳等药物注射导致肝组织损伤后肝内嗜中性细胞、单核细胞等免疫细胞增加，NLRP3表达升高，且主要表达于库普弗细胞等非实质细胞，肝细胞表达很弱。体外培养证实Kupffer细胞和肝窦内皮细胞高表达NLRP3、肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)低表达NLRP3、肝细胞基本不表达NLRP3，但是HSC和肝细胞体外受到LPS刺激后其NLRP3表达水平明显升高，并伴随IL-1β和TNF-α的升高[25]。急性肝衰竭发生时IL-1β、IL-18和caspase-1显著升高[26]，慢加急性肝衰竭早期患者单核细胞被LPS刺激后IL-1β水平显著高于健康人，而晚期患者其IL-1β水平降低[27]，IL-1受体拮抗剂治疗有助于缓解小鼠肝衰竭病情[28]。

NLRP3炎性体不仅是一个危险信号传感器，也是一个氧化应激和炎症性疾病的调节位点[10]。D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，GalN)和LPS常被用于研究肝脏炎症反应及其引起的暴发性肝衰竭导致肝脏功能障碍的发生机制。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是细胞保护酶，具有抗炎和对细胞氧化应激的抗氧化作用。HO-1可通过抑制NLRP3信号通路保护肝脏对抗GalN/LPS引起的炎症。Kim等[29]研究了GalN/LPS引起肝损伤的过程中NLRP3炎性体的激活以及HO-1在炎性体信号通路中的作用。C57BL/6小鼠在GalN/LPS处理前12 h、2 h分别先给予HO-1诱导剂氯高铁血红素和抑制剂锌原卟啉(ZnPP)。氯高铁血红素诱导HO-1逆转GalN/LPS引起的致死性损伤，而预先ZnPP处理能阻断这种改变。在GalN/LPS处理组，GalN/LPS处理后脂质过氧化作用显著增加而谷胱甘肽含量减少，血清IL-1β和TNF-α水平增加，肝脏IL-1β、TNF-α和NLRP3 mRNA增加，肝组织NLRP3、ASC 和caspase-1蛋白表达增加。氯高铁血红素能够减弱NLRP3与ASC和caspase-1的相互作用，而ZnPP又能消除氯高铁血红素的这种作用。GalN/LPS可诱导硫氧化还原蛋白(Thioredoxin-interacting protein，TXNIP)基因的表达并增强TXNIP与NLRP3的相互作用。研究结果提示，GalN/LPS诱导的炎症反应可能是通过TXNIP-NLRP3的相互作用引起NLRP3炎性体活化，HO-1可通过抑制NLRP3信号通路减轻GalN/LPS诱导的肝脏炎症。

在肝脏缺血/再灌注损伤后ROS介导的NLRP3和AIM2炎性体激活而引起的炎性反应中，库普弗细胞发挥重要作用。在产生氧化应激过程中信号激发炎性体的形成与激活。Leemans等[30]的研究显示在肝移植或肝脏外科切除术后，肝脏非实质细胞的NLRP3表达水平升高，伴随血浆IL-1β、IL-18水平升高，干扰NLRP3表达可以导致caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6等表达下降并显著减轻缺血再灌注损伤引起的肝脏炎症，抑制IL-1β、IL-18的表达同样有助于保护肝脏缺血再灌注损伤。Kim等[31]检测肝脏缺血/再灌注损伤中炎性体活化的分子机制以及ROS种类。发现肝脏缺血/再灌注损伤引起NLRP3和AIM2炎性体形成，血清释放IL-1β水平增加，泛连接蛋白-1(Pannexin-1)抑制剂和抗组织蛋白酶B抗体可减弱缺血/再灌注损伤引起的炎性体激活和肝损伤。肝脏缺血/再灌注损伤可增加TXNIP基因的表达，增强NLRP3与TXNIP的相互作用。应用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸处理能显著减弱肝脏缺血/再灌注损伤后IL-1β蛋白转化；应用氯化钆耗竭库普弗细胞可显著减少NLRP3和AIM2炎性体表达和信号通路的活化，也能减少F4/80阳性细胞中caspase-1蛋白表达水平。提示在肝脏缺血/再灌注损伤后ROS介导的NLRP3和AIM2炎性体激活的炎性反应中，库普弗细胞发挥重要作用。

内质网应激和非折叠蛋白反应与烧伤时增强肝脏NLRP3炎性体激活有关。大面积烧伤患者常常发生脓毒血症，特别是铜绿假单胞菌，延长代谢紊乱，促进多器官衰竭，增加病死率。然而感染相关代谢紊乱和器官功能不全的分子和细胞机制仍不清楚。既往研究结果显示，严重烧伤病人出现严重、持续的内质网应激，推测内质网应激和非折叠蛋白反应与烧伤时NLRP3炎性体激活有关，并可能激发肝脏明显的代谢改变，形成烧伤后肝脏损伤和肝功能不全的病理基础。研究在建立了体表烧伤面积60%和烧伤后3 d腹腔内注射铜绿假单胞菌LPS的大鼠二次打击模型1 d后，处死动物留取肝组织标本进行基因表达检测和NLRP3炎性体活化、内质网应激以及糖、脂质代谢分析，进行血浆ALT、AST等标志和肝脏组织化学检测了解肝脏损伤情况。结果显示，烧伤和注射LPS可诱导肝脏NLRP3炎性体激活，增强肝脏内质网氧化应激和肝损伤，进而加重烧伤后代谢紊乱[32]。

既往研究显示，对甲硫氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠应用泛Caspase抑制剂VX-166，可阻断IL-18的成熟分泌，从而减轻脂肪变性和肝纤维化[33]。在NLRP3敲除的小鼠，长期高脂饮食引起的肝脂肪变性情况减轻，提示NLRP3炎性体参与了NASH的发病机制[34]。炎性体激活在酒精性肝炎发病机制中亦有重要意义，近期研究表明NLRP3炎性体与酒精性肝炎Mallory-Denk小体(Mallory-Denk body，MDB)形成有关。Peng等[35]应用泛素双染色观察酒精性肝炎患者肝脏活检标本炎性体激活及其与MDB形成的关系，结果显示酒精性肝炎患者存在NLRP3炎性体激活，并提示MDB可能是炎性体激活程度的一个标志。

近年国内外在炎性体的构成、调控方面的研究已取得较大进展，NLRP3炎性体的激活参与了多种肝病的发生、发展，但对该领域的研究目前仍处于早期阶段，今后若能系统阐明炎性体激活及调控机制，则有助于寻找新的靶向药物，供临床诊疗。

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(本文编辑：冯珉)

(收稿日期：2015-08-27)

通信作者：辛绍杰，Email:xinshaojie302@163.com

基金项目：国家“十二五”科技重大专项(2012ZX10002004-005)；军队“十二五”重点课题(BWS11J075)