沙门菌检测方法研究进展

王　杰,陈颖钰,彭清洁,郭爱珍

(华中农业大学动物科技学院动物医学院/华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070)



沙门菌检测方法研究进展

王杰,陈颖钰*,彭清洁,郭爱珍

(华中农业大学动物科技学院动物医学院/华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070)

摘要：沙门菌不仅是一种重要的畜禽病原菌，而且还是一种主要的食源性致病菌，对畜牧生产和公共卫生都具有巨大的威胁。因此，加强对沙门菌的快速准确检测是保障畜禽生产安全和食品安全的一种必需且有效的手段。目前沙门菌的检测方法包括传统细菌分离和生化鉴定、分子鉴定和免疫学检测等方法，其中，传统细菌分离并做生化鉴定的方法虽被认定为沙门菌检测的金标准，但较为耗时；分子鉴定通过检测特异性目标片段的有无，在遗传物质水平上鉴定致病菌种属；免疫学检测法则对样品中抗原或者抗体进行检测。依据各方法的特点，在不同的实际运用过程中需要选择相应的检测方法，以便实现快速诊断、及时治疗和处置相关疾病与食品安全事件的目标。

关键词：沙门菌；检测方法；细菌分离；生化鉴定；分子鉴定；免疫学检测

引起沙门菌病的病原体属于肠杆菌科沙门菌属，主要寄生在动物肠道，可以通过侵袭肠道上皮细胞进入血液循环系统，进而引发宿主全身感染，出现败血症和菌血症，并可通过分泌细胞毒素或者引发机体产生免疫应答而导致机体呈现出腹泻、发热等症状[1]。

不同血清型沙门菌对不同宿主具有不同的感染力。在所有家畜中，仔畜是对沙门菌极为敏感的动物群体。能引起牛感染的沙门菌主要包括鼠伤寒沙门菌及都柏林沙门菌；引起猪感染的沙门菌主要是猪霍乱沙门菌、猪伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌；鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌是引起禽沙门菌病的主要血清型。

多种对动物致病的沙门菌是主要的食源性致病菌。在英国，由食源性疾病引起的死亡中，沙门菌占到了28%[2]；在西班牙的加泰罗尼亚自治区的医院里，有78%的急性胃肠炎病例是由沙门菌引起的[3]；在美国每年约有140万例沙门菌感染病例[4],并引起400多人死亡[5]。我国细菌性食物中毒中70%～80%归因于沙门菌, 且多因食用污染的肉、蛋、奶等动物源性食品而发病[6]。

因此，加强对动物机体内沙门菌的检测是保障畜禽健康和动物性食品安全的重要环节。

1沙门菌细菌学特征

沙门菌属是一群能寄生在人和动物肠道内的革兰阴性菌，兼性厌氧。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气，偶尔有不产气的，常产生H2S。

按照最新的分类方案，根据遗传物质脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)DNA同源性，本属菌可分为肠道沙门菌和邦戈尔沙门菌2种，共7个亚种；在血清型鉴定方面，沙门菌具有O、H、K和菌毛4种抗原，至少2 500个血清型，其中O抗原是每个菌株必有的成分。

本属菌具有极其广泛的动物宿主，是一种重要的人畜共患病病原。能引起人的伤寒、副伤寒、急性肠胃炎、败血症等疾病。还可以侵害幼龄动物发生败血症，对成年动物常常引起散发性疾病，可导致怀孕母畜流产。

根据对宿主的嗜性不同，又可将沙门菌分为3群：第1群是具有专嗜性，只对某些动物产生特定的疾病，例如鸡白痢、鸡伤寒、马流产、羊流产沙门菌等；第2群是在一定程度应用于特定动物的偏嗜性沙门菌，如都柏林沙门菌是牛和羊的强适应性菌株，但也能感染其他动物；第3群是泛嗜性沙门菌，具有广泛的宿主，其中的代表包括鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌。

2传统分菌方法

大多数的细菌鉴定方法其前提是分离出纯的细菌培养物。针对临床上肉、牛奶、粪便或者环境样本等多种样本类型，沙门菌分离方法也存在有差异：在国际上，欧洲大都采用国际标准化组织(international organization for standardization，ISO)的标准[7]；其中ISO标准针对粪便里的沙门菌的检测增加了一个附件说明[8]；美国有自己的细菌学分析标准；我国主要依照国家标准GB 4789.4—2010进行沙门菌的分离与鉴定。

传统细菌分离方法一般都包含如下四个步骤:

第一步：预增菌。传统检测技术前期都需要对样本进行预处理，使菌群溶解在液体中以方便操作。

无论是食品还是粪便，或经过加工使菌体受到损伤或由于目标菌种含量低，均需要进行复苏和增菌。针对不同的样品，不同检测标准的预处理方式也存在差异：缓冲蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)的作用在于能非选择性修复物理或化学伤害的细菌，适合处理食品样本；乳糖肉汤的缺点在于大部分肠杆菌均能在其中生长。

第二步，选择性增菌。不同的增菌液在促进沙门菌的生长方面均有不同的偏向性。改良半固体氯化镁孔雀绿增菌液有利于运动型沙门菌的检测[8]。亚硒酸盐胱氨酸增菌液(selenite cystine broth,SC)在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门菌的生长，四硫磺酸钠亮绿增菌液(tetrathionate broth base,TTB)是抑制除沙门菌外其他肠道菌群的生长。由于一种增菌液不可能适合所有的沙门菌生长，因此，对沙门菌进行选择性增菌要同时用两种增菌培养液。

第三步，选择性培养基上画线培养。乳糖生化试验阳性的沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆盐(xylose lysine desoxycholate agar,XLD)培养基上显示为非典型菌落,亮绿琼脂、亚硫酸铋琼脂作为补充性的选择性培养基，特别是适合于分离乳糖阳性的沙门菌、伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌的培养；有些沙门菌例如鸡白痢、鸡伤寒沙门菌生长缓慢，在XLT4 (xylose lysine tergitol TM 4 agar)上生长更好，菌落大小适中[9]，当然，由于鸡白痢和鸡伤寒沙门菌具有宿主适应性，所以在牛源沙门菌检测中可以认为XLD和XLT4无明显差异；在实际运用中表明添加无色的特异性酶作为底物的显色培养基，能大大减少挑选可疑菌落的数量。

第四步，纯化菌落。一般挑取可疑典型菌落在麦康凯培养基上划线，以获取单个纯菌落。

传统细菌分离方法通常需要3 d～5 d才能完成，耗费时间长，且非运动型沙门菌在环境样本中存活时间不长，因此对样本就需要及时处理；XLD和SS(salmonella-shigella agar)沙门菌-志贺菌琼脂培养基同时能用于志贺菌的分离，造成假阳性；在实际操作中，同一菌株在培养基上可能因为生长位置不同营养供给有差异，形成典型或者非典型菌落；同时由于对菌落的识别和挑取大多只限于经验的积累，因此传统方法的敏感度不高，主观性强；另外在不同部位分离出的沙门菌其生化结果并不是绝对一样的[7],增加了判定的复杂程度。

卢勉飞等[10]发现,国内外不同厂家4种沙门菌分离培养基在特异性和选择性方面基本一致，生长率差异不显著；Love B C等[11]比较了5种不同配伍的沙门菌分离方法，结果显示不同配伍方法间,效果差异显著且单一方法的检出率低；Cummings K J等仅用TTB一种增菌液发现纽约55个奶牛场环境中沙门菌携带率为22%[12]。所以很多标准建议,在第二步和第三步分别至少使用2种以上培养基进行筛选。

3生化鉴定方法

参照沙门菌属生化反应鉴别标准将纯化后的菌落进行生化试验，进一步确定其是否为沙门菌。将确定的沙门菌再做血清型检测以确定其血清型。

Seran等发现在单份样本中会存在多种血清型沙门菌，且这种存在几率并非偶然[13]，从而提醒在上述第四步纯化菌落时，应注意选取多个可疑菌落进行纯化，然后分别做生化试验和血清学试验，以免丢失单个样本中的多个血清型；生化鉴定过程繁琐、鉴定管颜色变化的判定存在主观因素，是此种鉴别方法的最显著缺点。传统方法虽然是各国公认的“金标准”，但由于其时间的滞后性，难以满足快速检测的要求，因此有必要发展更为准确、快捷的沙门菌检验方法。

4分子鉴定方法

以核酸检测为基础的分子生物学鉴定方法能够通过检测特异性目标片段的有无，在遗传物质水平上鉴定致病菌种属。

此类方法通过一定的技术在体外对目标基因DNA 片段进行快速扩增，使其达到检测手段所需要的检查量，然后再由后续的检测方法做出最终判定[14]。目标基因一般是选择细菌的管家基因中的一段或几段特异性序列或者含特异性酶切位点片段用以在遗传物质水平上检测区分。而血清学分型是在其蛋白表达表型方面对其同种异性进行区分。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是现在最普遍使用的DNA扩增技术，在生物信息学研究基础上发展的PCR技术不仅能区分生化群，还能通过对多条目的基因的筛选来鉴定其血清型。从Rahn开始运用此方法到现在，用于沙门菌检测的PCR方法引物设计多基于invA、stn、16 S rDNA、phoP等保守基因。这些序列大部分为沙门菌特有的毒力相关基因，存在于染色体或毒力质粒上[15]。Ziemer C J等[16]在试验中，发现以沙门菌stn、16 S rDNA、组氨酸转运操纵子(histidine transport operon)3种保守基因设计的引物，对多种非沙门肠道菌的阴性率为100%。Yan L等[17]运用沙门菌相关引物检测沙门菌的灵敏度能到达到1 CFU/ 25 g，具有很高的灵敏度，但是Jensen A N等[18]认为real-time PCR在检测亚临床感染样品时的灵敏度和传统细菌检测学方法无差异。

随着PCR的快速高效的优点逐渐为人们所知，PCR技术不仅在更广泛的领域中得到运用，研究人员还不断对其进行了完善。

重复基因外回文序列PCR(Rep-PCR)是一种通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复回文序列，然后根据电泳条带的大小和带型来区分细菌种类的改良型PCR方法；实时荧光定量PCR解决了普通PCR不能定量检测致病菌数量的难题，同时因为在核酸扩增的过程中就能看到检测结果，明显的缩短了检测时间，石晓路[19]指出，在此方法中应注意增菌液对荧光PCR反应的影响；反转录PCR(RT-PCR)由于对细菌的数量和活力有要求，在检测前需要增菌培养，由于RT-PCR能指示活菌的存在，所以在检疫方面具有实际意义[20]；由于PCR体系中可能存在多种因素影响片段的成功扩增，单一特异性目标片段技术的假阴性较高，因此扩增内标的添加是必不可少的。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是21世纪以后开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，相比较普通PCR而言，它在省去了高温变性过程同时也实现了肉眼观察结果的技术，节省时间的同时降低了使用同位素的污染，还可实现高通量检测[14]。Fan F等[21]构建了一种检测组织沙门菌的LAMP方法，在细菌低拷贝数的前提下，其灵敏度比RT-PCR高10倍，同时还缩短了3 h 的检测时间，大大提高了检测的灵敏度。但同时LAMP技术也存在引物设计要求较高、较高的假阴性率和对目标靶序列长度要求短等缺点。

随着第三代基因组测序技术单分子实时DNA测序的发展，进一步促进了基因组测序向快速、高效,长片段检测方向的发展。未来基因组测序技术若能广泛应用并且将鉴定范围精确到种，将会大大提高实验室病原体的检测效率。

需要指出的是分子鉴定方法由于其大部分设备造价昂贵,而单个样品检测费用相对设备价格十分便宜，适合综合诊断室研究使用，同时此种方法适合在价值较高的动物身上使用，不利于在养殖场推广。

5免疫学检测法

免疫学检测法包括乳胶凝集技术、胶体金试纸条检测技术、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、斑点免疫层析法、免疫磁珠分离技术、免疫标记技术等。在养殖场常常利用试纸条进行检测，其他技术常见于在实验室运用。此类方法原理是对样品中的特异性抗原或抗体进行检测。由于抗原抗体能在短时间内完成结合反应，技术可实现自动化，劳动强度比传统培养鉴定方法降低很多，因此适合在大规模监测项目中应用。

由于我国国民肉类消费以猪肉为主，针对猪源沙门菌的检测，相应的商业化检测试纸条和ELISA试剂盒产品已经十分成熟；在瑞典和丹麦已经实现对牛源都柏林和鼠伤寒2种沙门菌血清型ELISA抗体检测试剂盒的商业化生产。

免疫学检测方法相比较前两种方法的优点在于不需要对细菌进行纯化。胶体金试纸条使用方便、其结果分析快、肉眼可见，但灵敏度一般。Preechakasedkit P等[22]发明的胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度为105CFU/mL。ELISA技术相对于试纸条检测所需时间长，对人员素质和设备要求较高，近年来,此方法的改进主要集中在单抗和多抗的开发[23]，以及新型聚合物膜材料的开发以提高其灵敏度。Jain S等[24]开发的改良聚碳酸酯膜应用多克隆O型抗体在检测没有经前增菌处理的伤寒沙门菌时的灵敏度能达到2×103CFU/mL；免疫磁珠是指具有超顺磁性、表面能被-OH、 -NH2、-COOH等基团或者抗体修饰、形成具有很好的生物亲和性的粒子, 需要指出的是，免疫磁珠分离技术能有效捕获食品加工过程中“致伤”的病原菌，进而在一定程度上能有效节省前增菌所花费的培养时间，同时能将沙门菌检测灵敏度提高到103CFU/mL[25]。

随着人们对疾病检测方便性的需要，更多的栏圈旁检测(point of care testing，POC)可移动式装置被创造出来。微流体技术就是其中典型代表之一，它是将样品制备、生化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上，在数十微米级宽的通道上分析处理小批量液体的一种技术，有样品需求用量小、敏感性强、分析快速等优点[26]。与传统ELISA方法相比，POC在某些方面可以替代甚至弥补其不足，如紧急救护，贫困地区，无合格实验室地区。研究者凭借其为载体，结合现有方法，不仅提升了检测的质量，还促进了检测的方便性[27]。在台湾，POC检测最终为人们广泛接受花费了近30年的时间，而在国内却刚刚起步。虽然这种技术还处于早期阶段，仍然有许多需要改进的地方，但因其不受检测场所和运输条件的限制，很可能是未来技术发展的一种趋势。

6小结

综上所述，虽然沙门菌检测方法多种多样，但是由于各自技术特点，在不同的实际运用情况下需要选择相应的检测方法以达到经济或者科研目的。

传统细菌分离方法应用于活菌株的收集，但其灵敏度低；生化试验是公认的确定细菌种属的方法；PCR方法灵敏度高，三者结合有利于在实验室条件下对临床和亚临床沙门菌病的调查、诊断和健康牛群筛选，此方法还适用于组织中低浓度细菌的检测。同时，应用细菌噬菌体分型方法，有利于疾病暴发时的诊断[28]。

免疫学检测方法由于其灵敏度低的缺点适合针对发病群体进行检测，胶体金试纸条和ELISA试剂盒操作方便，结果易于读取，适合在养殖场中推广使用和大批次的调查。

随着微流体技术的发展，若其能够实现成熟化，未来将有利于促使诊断操作从实验室中解放出来，从而在沙门菌净化过程中发挥巨大作用。

还有很多其他方法在未来都有很好的前景，但是对病原菌的有效检测仍是未来临床传染病检测技术共同的发展目标。实践证明，加强管理，采取有效隔离措施，能减少沙门菌病的发生[29]。参考文献:

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Progress on Detection Methods ofSalmonella

WANG Jie,CHEN Ying-yu,PENG Qing-jie,GUO Ai-zhen

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology，HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

Abstract:Salmonella is not only an important pathogen of livestock,but also a significant food-borne pathogen and is a great threaten to the production of animals and public health.To detect Salmonella quickly and accurately is effective and necessary for the animal production safety and food safety.Traditional bacterium isolation and biochemical identification,molecular identification and immunological detection are the main methods for Salmonella detection now.Among which, traditional bacterium isolation and biochemical identification are regarded as the "gold standard",but take time;molecular method is available for identification of the pathogen species in genetic level by test the target fragment;immunological method is to detect the antigens and antibodies.Based on the different features,we should choose different method for detection according to the situation to realize the goals of rapid diagnosis of treatment and disposing related diseases and food safety incidents.

Key words:Salmonella;detection;bacteral isolation;biochemistry identification;molecular identification;immunological detection

文章编号:1007-5038(2016)04-0094-05

中图分类号:S852.612

文献标识码:A

作者简介：王杰(1991-)，男，河南武陟人，硕士研究生，主要从事动物流行病学调查。*通讯作者

基金项目：公益性行业(农业)科研专项(201403054)

收稿日期：2015-09-04