猪链球菌病的检测方法研究进展

谭娅，史开志，王婧，尚以顺

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

猪链球菌病的检测方法研究进展

谭娅，史开志，王婧，尚以顺*

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

猪链球菌病是一种重要的人畜共患病，对猪链球菌进行快速而特异性检测具有重要的流行病学意义和临床应用价值。文章分别对猪链球菌的微生物学检测、免疫学检测和分子生物学检测方法进行了综述，以期为猪链球菌检测提供参考。

猪链球菌;免疫学检测方法;分子生物学检测方法

猪链球菌病是由猪链球菌(Streptococcus suis，SS)引起。猪链球菌革兰氏染色呈阳性，按其荚膜多糖不同可以分为35个血清型:1～34型和特殊型1/2型，其中1、2、1/2、7、9、14型等均具有致病性，以2型(SS2)致病能力最强，影响范围最大。此外，仍有大量猪链球菌未分型。猪链球菌病是我国养猪业面临的重大传染病之一，此病分布范围极广，世界各地均有发生，并且发病急、病程短、死亡率高，各种年龄和品种的猪都可以发病，猪链球菌不仅可以侵入血液循环而造成肺炎、关节炎、淋巴结炎等，而且可以穿过血脑屏障和胎盘屏障导致脑膜炎及母猪流产［1］。同时猪链球菌2型通过伤口及呼吸道等途径可以感染人，引发人的关节化脓性炎症、脑膜脑炎及心内膜炎等，严重的可致死亡，已被列为国家二类动物疫病。

目前对猪链球菌病的鉴定方法有微生物学鉴定、血清学鉴定及分子生物学鉴定等技术手段，生化鉴定方法一般作为补充。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、协同凝集试验、毛细沉淀或平板凝聚试验，其中ELISA与协同凝集试验的应用最为广泛;分子生物学方法包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术、基因芯片技术、核糖体分型技术、分子伴侣(Cpn60)基因对SS进行基因分群、随机扩增DNA片段多态性分析、脉冲场凝胶电泳等［2］。

1 微生物学方法

猪链球菌可根据细菌的形态、培养特性和生化特性等进行鉴定。链球菌在显微镜下呈圆形或卵圆形，直径小于0．2 μm，一般呈链状或双排列。革兰氏染色阳性，除D群个别细菌外，均无鞭毛，多数有荚膜。血琼脂平板上可长成直径0．1～1．0 mm、灰白色、表面光滑、边缘整齐的小菌落，多数致病菌株具有溶血能力，溶血环的大小和类型因菌株而异。凡具有α－溶血、淀粉酶阳性和V－P试验阴性的链球菌可认为是猪链球菌。对于生化反应，认为鉴别意义较大的有:6．5%NaCl生长，精氨酸双水解酶阳性，V－P试验阴性，乳糖、蔗糖、甘露醇、纤维二糖、水杨素、甘油和山梨醇均为阳性。

2 免疫学方法

2．1 酶联免疫吸附(ELISA)

2．1．1 针对以全菌、荚膜多糖为抗原的间接ELISA方法所得结论不一。Vecht U等［3］利用双抗体夹心酶联免疫吸附试验对猪链球菌2型致病菌株与非致病菌株进行研究，试验结果表明，建立的2个DAS－ELISAs在诊断猪链球菌2型致病菌株方面具有快速、可靠、简单等优点，mrp和epf的DAS检测结果与western blot的检测结果几乎一致。李明等［4］选用SEZ与SS2的全菌(WAC)、超声波抗原(UA)、荚膜多糖(CPS)作为抗原，建立起检测2种抗体的间接ELISA方法。通过比较发现，检测SS2抗体的3种抗原中，CPS阳性率最高，特异性、稳定性好，在诊断和流行病学调查方面有重要应用价值。孙智远等［5］用酶标SPA代替二抗，建立PPAELISA，并同时对豚鼠、家兔、猪血清进行检测，结果反应灵敏，避免了使用多种二抗造成的麻烦，具有敏感性强、简便、快速等优点，适于基层养殖场大批猪血清样品抗体水平的普查。徐敏等［6］以纯化的原核表达的猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)为抗原，建立了检测猪链球菌抗体的间接ELISA诊断方法，结果表明该方法特异性、敏感性和重复性均较好，适用于猪链球菌所有亚型的抗体检测。大量的试验结果表明，ELISA方法操作简便、经济、快速，且该方法在中国各级兽医检测部门已应用多年，适合推广应用。

2．1．2 斑点酶联免疫吸附法(Dot－ELISA)的原理与常规ELISA法相同，但该方法的操作更为简单、快速，结果易于观察，无需任何特殊的仪器设备，适用于基层兽医及养殖场。欧瑜等［7］提纯猪链球菌的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)并制备其抗体，用此抗体建立了Dot－ELISA和间接ELISA检测法，对17株猪源链球菌和1株猪链球菌2型人分离株进行检测，结果显示，2种ELISA的检测结果一致，MRP和EF的阳性率均为61%(11/18)。李金海等［8］以高压法提取抗原作为诊断抗原建立Dot－PPA－ELISA法用于检测猪链球菌抗体。冯朝兴［9］以HRP－SPA代替第二抗体，建立起Dot－PPA－ELISA用于联合检测猪瘟、猪链球菌、猪巴氏杆菌血清IgG。

2．2 胶体金免疫层析技术(GICA)胶体金免疫层析技术是近十年来迅速发展的一种将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起的新型体外诊断技术。GICA具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备等优点，已成为临床及检疫诊断领域发展的一个新方向。杨俊兴等［10］用胶体金标记葡萄球菌蛋白A(SPA)作探针，用纯化的SS2 CPS和健康猪IgG分别作为检测线试剂和对照线试剂，研制了一种SS2抗体快速检测试纸条，用该试纸条检测16份SS2感染康复猪血清抗体和24份SS2高免猪血清，试纸条检测为100%阳性，与ELISA法检测结果完全一致。鞠莹等［11］用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，标记SS2多克隆抗体，通过免疫层析作用对SS2型进行检测，并对试纸条的敏感性、特异性、稳定性进行评价，确定胶体金最佳抗体标记量为22 μg/mL，最佳包被抗体浓度为2 μg/mL，建立的胶体金免疫层析试纸条检出SS2型的下限为106CFU/mL，从检测到结果判断时间为5～15 min，与其他常见致病菌及链球菌属中15个群无交叉反应，表明该法操作简便、灵敏度高、特异性强，可用于SS的快速初筛和检测。

2．3 荧光检测技术免疫荧光技术是在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。于新和等［12］将所提取兔抗猪链球菌IgG用FITC标记后并进一步用G50过滤，制备出兔抗猪链球菌荧抗体。同时利用吸收试验、特异性抑制试验对自制的荧光抗体进行了检验。结果表明，利用自制荧光抗体进行链球菌病的诊断可在2～3 h内对链球菌作出诊断，比直接镜检更具有特异性和敏感性。武红敏等［13］通过合成具有高发光效率的巯基乙酸修饰的CdSe/ZnS量子点，制备基于猪链球菌2型的重要致病毒力相关因子——溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体的CdSe/ZnS量子点荧光探针，利用这种探针建立起1种检测MRP抗原的新方法，该方法的线性检测范围为5．0×10－8～1．5×10－6mol/L，检测限为1．9×10－8mol/L，为猪链球菌病的检测提供了一种新方法。

3 分子生物学方法

3．1 聚合酶链式反应(PCR)

3．1．1 PCR是近年来畜禽疾病诊断的常用技术，具有很强的特异性和高度敏感性。谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关序列orf2等具有特异性，在SS不同分离菌株间有一定保守性。为检测所有血清型或致病性菌株，Okwumabua等［14］根据2型菌株sly序列设计引物建立了PCR方法，但试验结果显示该法不能检出所有血清型或致病性菌株。依赖2型菌株gdh序列设计引物可建立SS分型PCR，能特异性地检测SS所有血清型菌株［15］。由于荚膜多糖是SS 35个血清型鉴别的直接依据，Smith HE等［16］针对SS主要致病菌株荚膜基因的DNA序列设计引物，建立了血清型特异性PCR鉴定方法。

3．1．2 多重PCR能够同时扩增不同片段，具有普通PCR方法不可比拟的优势。Sliva LM等［17］根据gdh、cps基因序列设计引物，可鉴定SS并进行分型，还首次证实了cps9菌株的毒力相关基因。聂小想等［18］建立了多重PCR检测体系实现了对SS毒力相关因子基因mrp、epf和sly的同步检测。对16株种属背景明确的试验菌株及14株猪临床分离的链球菌样本进行检测分析，结果16株SS中mrp检出率为25%，epf检出率为12．5%，sly检出率为31．2%，阴性对照毒力因子检测结果均为阴性。

3．1．3 实时荧光定量PCR(Q－PCR)能够方便、快速、准确地进行病原体的检测。利用Q－PCR检测病原体可以判断疾病是否处于隐性或亚临床状态，以及解决抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染的疑难诊断问题。孙洋等［19］以荚膜抗原编码基因簇中的特异性基因cps2J为靶基因，建立了猪链球菌2型的SYBR Green荧光实时定量PCR检测方法。通过标准曲线的建立，实现了对目的菌的实时定量检测。该方法能够准确反映出感染或污染的强度，在很大程度上避免了假阳性的检测结果，进一步完善了猪链球菌的检测方法。

3．2环介导等温扩增技术(LAMP)LAMP技术是一种新型核酸扩增技术，因其具有特异性强、敏感性高、简单、快捷及不需要昂贵的仪器设备等特点，受到了研究者的高度关注。朱水荣等［20］根据SS2中国分离株89K毒力岛中基因序列设计4条引物，应用LAMP技术对21株SS2、18株其他链球菌、9株葡萄球菌、5株其他菌株及49份未知样本进行检测，并对LAMP的最低检测限进行测试，通过肉眼目测或电泳检测结果，并将结果与PCR/定量PCR结果比较，结果表明，该方法仅对含89K毒力岛的中国SS2特有株检测为阳性，而其他菌株经LAMP检测均为阴性，表明建立的方法特异性好，其最低检测限为24CFU/反应。应用建立的方法对49份不同来源样本进行检测，其中32份不明发热病人呼吸道咽拭子应急样本及15份正常猪扁桃体咽拭子样本经检测89K毒力岛基因均为阴性，2份疑似SS2病人血液应急样本中1份检测到该毒力岛基因，该结果与普通PCR/定量PCR检测结果一致。张凤玉等［21］建立针对高致病性SS2 89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的LAMP方法并进行了优化，其检测灵敏度为1．53×10－1拷贝/反应，全部扩增检测可在60 min内完成，可用于高致病性SS2快速检测。

3．3 基因芯片技术基因芯片是通过将大量核酸探针以微列阵固定于支持物上，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过检测荧光信号强度来分析获得待检样本的基因信息，因而可实现高通量、多靶基因的检测和分析。随着大量病原微生物基因组序列测定的完成，基因芯片在致病微生物快速检测中得到广泛应用。郑峰等［22］根据SS cps1(检测SS1和SS14)、cps2(检测SS2和SS1/2)及cps9基因的保守区设计型特异性寡核苷酸探针，达到了对SS主要致病血清型的鉴别，而针对不同菌株设计的特异性探针未获得预期检测效果。该芯片体系作为一种检测SS种、致病血清型和毒力因子的新方法，具有较好的特异性和敏感性，对于高通量鉴定SS菌种及其毒力有重要价值。

3．4 利用核糖体(16S)基因和分子伴侣(Cpn60)基因分型技术

3．4．1 核糖体分型技术(Ribotyping)是在RFLPDNA印迹的基础上发展起来的1个分型方法。菌体16S rRNA具有群间特异性，且其序列高度保守，可以为细菌的诊断及流行病学调查提供帮助。而核糖体分型技术就是选用细菌核糖体中16S和23S rRNA为杂交探针。Staats JJ等［23］运用核糖体分型技术对猪链球菌毒力进行研究，经DNA提取、酶切、电泳分离、DNA印迹后，用地高辛标记的16S、23S rRNA反转录cDNA作探针杂交，结果发现该方法能同时区分SS2菌株与非致病菌株。

3．4．2 Chatellier［2］测定了猪链球菌35个血清型的16S rRNA序列，并对16S rRNA序列进行了相似性分析，结果显示各菌株之间的相似程度在93．94%～100%之间。除去亲缘关系较远的32、33、34型，另外的32个血清型可定为1个群。根据基因的差异，该群32个血清型的32株细菌可进一步分成3个簇。这32个血清型16S rRNA的48～91 bp为高变区，92～1 468 bp是高度保守区。虽然不同种链球菌16S rRNA的差异碱基集中在相对狭小的高变区，但碱基的差异确实存在，而且16S rRNA序列的变化与分离地域、来源动物的健康状况等无关，所以根据16S rRNA序列设计引物，先快速地鉴定SS，然后再结合其他型特异性引物进一步鉴定基因分型，此方法己被广泛应用。

3．4．3 分子伴侣(Cpn60)基因具有普遍存在性，高保守性和部分变异性，可进行SS进行基因分群，应用于分子诊断和分子鉴别。Brousseau R等［24］将猪链球菌35个血清型编码的Cpn60的基因进行扩增、测序，Cpn60部分基因分析结果显示，35个血清型Cpn60基因的分群结果与16S rRNA的分群结果相同。Cpn60的系统进化树与16S rRNA的系统进化树相似，同样也出现了群聚，所以该方法也能从链球菌属中鉴别出猪链球菌，并且还可以根据Cpn60的高变区进一步设计特异性引物，为快速鉴定血清型提供可靠的方法。

3．5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)脉冲场凝胶电泳是通过酶切细菌基因组，然后对酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳，不断改变电场方向，从而在凝胶上获得多态性DNA图谱。PFGE以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子生物学分型技术“金标准”。PFGE在分离酵母染色体获得成功，随后就应用于诊断领域。在国内，田云［25］为了寻找区分猪链球菌7型菌株的毒力株和弱毒力株的方法，对54株7型猪链球菌(包括24株核糖型2分离株)进行了遗传多样性分析，共发现了50种PFGE型。可被划分为A和B 2个群落，群落B可以被进一步划分为3个亚群(B1、B2和B3)。王丽丽等［26］利用PulseNet技术优化猪链球菌PFGE分子分型方法，提出新的分析方案，包括胶块的制备、内切酶的选择、电泳条件等。此优化后的PFGE较原方法所需时间短、图像清晰，更具有可重复性，基本具备推广的条件。

4 结语

猪链球菌分型多并且在临床上易发生与其他疾病混合感染，对我国养猪业影响重大，在生产实践中，可将以上几种方法结合起来使用，用于确诊，对于猪场暴发猪链球菌病进行及时诊断及防控研究具有积极意义。尽管对猪链球菌的鉴别诊断研究取得了一定进展，仍有许多问题有待进一步研究，如能否找到猪链球菌致病株特异性的毒力因子，尽早制造出可以对猪链球菌进行有效预防的基因工程疫苗，以及对猪链球菌耐药性机理的进一步探索。

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The Research Progress of Streptococcus suis Detection Methods

Tan Ya，Shi Kaizhi，Wang Jing，Shang Yishun*
(Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang Guizhou 550005，China)

Streptococcus suisis a severe zoonosis in pig industry，and the rapidity as well as specificity of detection is not onlyimportantin epidemiology but also valuable in clinical application．In our review，we summarized three methods to detect Streptococcus suis，that is microbiological detection，immunological detection and molecular biological detection．All these may provide reference methods to Streptococcus suis detection．

Streptococcus suis;Immunological Detection;Molecular Biological Detection

S858．28

A

1007－1474(2016)06－0018－05

2016－09－22

科研机构服务企业行动计划项目(黔科合服企［2015］4003号);贵州省农业攻关项目(黔科合NY［2013］3072号);贵州省现代生猪产业体系建设项目(GZCYTX2015－09)

谭娅(1989—)，女，硕士，主要从事猪遗传与分子育种。

*通讯作者:尚以顺(1969—)，男，研究员，硕士，主要研究方向为草业科学和猪遗传育种以及疫病防治。