肌红蛋白在氧化镍纳米粒子中的固定及新型生物传感器的制备

马大威

(黄石市阳新县第三人民医院，湖北黄石 435000)

·临床研究·

肌红蛋白在氧化镍纳米粒子中的固定及新型生物传感器的制备

马大威

(黄石市阳新县第三人民医院，湖北黄石 435000)

摘要:目的对肌红蛋白(Mb)在氧化镍纳米粒子中的固定情况和新型生物传感器的制备情况进行探讨。方法测试氧化镍纳米粒子改性石墨电极(GE)上Mb所表现出来的电化学情况，同时进行新型生物传感器制备。结果Mb固定在Mb/氧化镍(NiO)/二甲亚砜(DMSO)膜中时，其分子所具有的活性能够得到更好的维持，其对H2O2具有电催化活性，且表观米氏常数具体为0.21 mmol/L、灵敏度表现为417mA cm2L/mol,具有极高的亲和性；Mb的检出限表现为0.039 μmol/L。结论Mb存在明显和稳定的氧化还原峰，Mb分子与电极间发生的电子传递受到DMSO的严重影响；将其固定于Mb/NiO/DMSO膜中时，更有利于其分子活性的维持，其对H2O2表现出高亲和性。

关键词:肌红蛋白；氧化镍纳米粒子；新型生物传感器

肌红蛋白(Mb)为具有1个含铁血红素辅基和153个氨基酸的多肽链共同组合而成的一个亚铁血红素蛋白，其相对分子质量为17.5×103，其在机体中主要存在于心肌、骨骼肌等组织中[1]。加强对蛋白质电催化、直接电化学的深入研究，对认识机体电子转移机制、相关具有生命物质在机体中的代谢情况等均具有极为重要的价值[2]。目前，诸多学者在研究过程中，利用纳米材料、离子聚合物等进行组装、交联等之后，使血红素蛋白质能够被固定在电极表面，进而实现对Mb与电极存在的传递关系进行研究。本研究中主要对Mb在纳米粒子上的固定情况进行探讨，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料在本研究中，在石墨电极的表面进行氧化镍(NiO)纳米粒子修饰，然后将Mb固定于石墨电极的表面，进而实现对蛋白质在电极上所发生的直接电化学行为进行分析和研究。

1.2仪器与试剂本研究所应用到的相关仪器主要有：CHI660C电化学工作站(生产企业：上海辰华仪器公司)、Vector22FT-IR傅立叶红外光谱(生产企业：Bruker公司)、扫描电子图像分析仪(生产企业：德国Gemini公司)、TU-1901双光束紫外可见分光光度计(生产企业：北京普析通用仪器有限责任公司)，此外还有石墨电极(GE)和饱和甘汞电极(SCE)。研究中所用的试剂主要有：M1882 Mb，研究所用水均为二次蒸馏水，使用到的其他试剂全部为分析纯。研究过程中还需要溶液A、溶液B、溶液C共3种溶液；A种为Mb浓度为2.0 g/L水溶液；B种为NiO浓度为4.0 g/L二甲亚砜(DMSO)悬浮液；C种为溶液NiO浓度为4.0 g/L水溶液。

1.3方法(1)纳米NIO制备：本研究主要应用气相法中的喷雾热分解法来实现纳米NiO的制备；(2)电极制备：本研究所用石墨电极的面积为0.263 5 cm2。进行试验之前，首先需对石墨电极进行打磨处理，然后使用氧化铝(0.05 μm)在麂皮上继续实施打磨操作，使其呈现出镜面。在实施抛光操作之前，均须使用二次蒸馏水对电极进行彻底清洗。抛光操作结束之后需要依次使用丙酮、二次蒸馏水对电极进行超声清洗，清洗的时间为5 min，清洗完毕后将其放置于室温环境中晾干；(3)电极制备：本研究需进行6种电极的制备，其分别为裸电极、NiO/DMSO/GE电极、Mb/GE电极、Mb/NiO/GE电极、Mb/DMSO/GE电极、Mb/NiO/DMSO/GE电极。将所有电极放置于干燥瓶中，放置时间为2 h，使水分得到有效挥发，进而形成均匀膜。将电极放置于密封瓶中，放置时间为12 h，密封瓶恒温为18 ℃。电极制成之后使用二次蒸馏水将其进行彻底冲洗，然后进行护理放置以备研究使用。测试方法：本研究应用的电极系统为三电极系统，首先将GE修饰成为工作电极，而辅助电极则为铂丝，参比电极为SCE。电极系统设计好之后将其与电化学工作站进行连接，然后实施电化学测量试验。在无特别说明的情况下，将相对于SCE的电位作为测量中的电位值均。实施循环伏安试验的环境，须将恒温控制在(18±0.2)℃的范围内，且整个试验须在静止的电化学电解池中实施。在测试过程中，合理地将电解池温度升高，且相应温度位置保持时间为20 min恒温，然后对循环伏安图进行记录。通过这样的方法来实现对Mb/NiO/DMSO/GE所表现出来的实际稳定性进行分析。在实施试验之前，需进行的相关电化学测试(均通过时间为15 min的纯氮，将存在于电解液中的溶解氧去除)。在试验实施的整个过程需始终保持处在氮的环境中。实施安培检测操作时，将工作电位设置为-350 mV，将检测所测得的电流-起始电流所得数值作为催化电流。在聚四氟乙烯片上分别滴上Mb，Mb/DMSO溶液，Mb/NiO/DMSO或Mb/NiO/H2O悬浮液，然后将聚四氟乙烯片放置于空气中进行晾干，然后揭下膜，实施KBr压片操作之后进行测试。将20次扫描所得结果的平均值制成每次测量的图谱。分别在玻璃片上进行NiO修饰、Mb修饰、Mb/NiO/DMSO修饰，然后实施扫描电子图像分析。

1.4统计学处理本研究所得相关数据均使用Microsoft Excel 2003进行统计学分析和处理。

2结果

当Mb混合到水、DMSO溶液、NiO/水悬浮液、NiO/DMSO溶液中时，Mb均能够保持其原有的结构；将Mb固定在Mb/NiO/DMSO膜中时，更利于保持Mb分子的活性，且其天然结构也不会遭受破坏,其对H2O2具有电催化活性，且表观米氏常数具体为0.21 mmol/L、灵敏度表现为417 mA cm2L/mol,具有极高的亲和性，Mb的检出限表现为0.039 μmol/L；当pH值在5～10范围之内时，溶液pH值与式量电位表现出线性关系，其斜率为-42.3 mV/pH(r=0.999 3)，不仅接近于-43.9 mV/pH，同时也与291K时的理论值(-57.8 mV/pH)接近，这说明Mb的电子传递受溶液pH值影响。

3讨论

Mb为一种氧结合蛋白，其在机体中主要存在于平滑肌、骨骼肌、心肌等组织中。存在肌肉中的所有蛋白中，Mb所占比例为2%左右[3]。Mb具有极小的相对分子质量，其相对分子质量仅为17.8×103，明显小于肌酸激脢(CK-MB)和乳酸脱氢酶[4]。Mb位于细胞质的内部。在病理生理学中，存在于机体中的心脏标志物出现时间的早晚和分子在细胞中的部位、分子大小均存在密切联系。相对分子质量越小，更易于其直接透过细胞存在的微小间隙，进入到血液中。所以当心肌损伤发生时，Mb会较早出现，目前，其为急性心梗出现之后能够最早检测得到的标志物。

当Mb处在溶液时，其对溶液的吸收均会存在一个吸收峰，这个吸收峰就是其在该种溶液中的Soret吸收带[5]。但Soret吸收带消失或者发生迁移时就提示蛋白质的结构出现了相应的变化。在Mb分子中，多肽链二级结构信息主要依靠酰胺Ⅰ、Ⅱ红外吸收带提供。在蛋白质失去活性时，其分子中的酰胺Ⅰ、Ⅱ所具有的特征吸收带会发生明显变化，吸收带甚至会完全消失[6]。本研究结果显示，当Mb固定在Mb/NiO/DMSO膜中时，其分子活性不易失去，且天然结构也不会发生明显变化。

DMSO在蛋白质电子传递过程中发挥着极为重要的作用，导致这种现象出现的原因主要为DMSO能够降低存在于Mb分子周围环境中双电层常数，进而降低了蛋白质电子在进行传递过程中外部重组能，最终导致蛋白质电子在传递过程中的速度不断加快[7]。但是在Mb电子传递过程中，NiO纳米粒子发挥着更加重要的作用，NiO纳米粒子可创造出一个三维界面，这个三维界面能够让受限的方位同样也适合蛋白质分子与电极表面间的直接电子传递，因此，蛋白质分子的电子传递会得到有效加快[8-9]。同时，NiO纳米粒子具有强烈的吸附性，其更多的Mb会被其吸附，且将Mb吸附之后洗脱难度大，因此表现出较强的信号。

在本研究中，当将Mb/NiO/DMSO/GE在pH值为7.0的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)中进行连续性扫描时发现，其表现出来的标准偏差为0.887%，这个标准偏差表明Mb/NiO/DMSO修饰电极存在良好的重复性。当将修饰电极放置于恒温为4 ℃，pH值为7.0的PBS中，放置时间为60 d，然后进行测试，测试结果显示峰电流值是原来峰电流值的94%，这个结果表明Mb/NiO/DMSO/GE存在良好的稳定性。将蛋白质固定在导电性物质表面时，其出现的行为会和其所处于溶液中的行为发生一定的变化。热力学稳定性试验所得结果表明，Mb/NiO/DMSO/GE热力学稳定性的增加与NiO纳米粒子的存在具有密切联系[10]。

溶液中的pH值对Mb直接电子传递存在明显性影响。当溶液的pH值处于5～10的范围之内时，溶液pH值和式量电位表现出明显的线性关系，具有-42.3 mV/pH的斜率，该斜率接近于-43.9 mV/pH，同时也与291 K时的斜率理论值较为接近。这个结果表明，在电子传递过程过程中还有1个电子和1个质子参与。当溶液的pH值为7.0时，电子传递出现最高的峰电流值。因此在进行实验时，所应用的电解质溶液通常会选择pH值为7.0的PBS缓冲体系。

对于H2O2，Mb/NiO/DMSO/GE表现出明显的电催化作用。当将H2O2加入到pH值为7.0的PBS中之后，还原峰电流会表现出明显增加的趋势，而氧化峰电流则表现出明显减小的趋势。这种现象在NiO/DMSO/GE上，或者在裸GE上均未出现。这种表明，H2O2所表现出来的催化还原作用主要是由于有Mb分钟存在于电极上，且H2O2表现出来的催化效果具有明显性。在本研究中，当在连续性地将适量的H2O2加入到pH值为7.0的PBS中时，在将工作电位选择为-350 mV时，修饰电极对H2O2表现出较为理想的电催化活性，同时，在短短5 s的时间之内，稳态电流可高达95%。这个结果说明了电催化响应具有极快的速度，所以可有应用于H2O2的检测，且会大大提高检测的速度。

参考文献

[1]李晶，杨晓英．新型碳纳米材料——石墨烯及其衍生物在生物传感器中的应用[J]．化学进展，2013，10(Z1)：380-396．

[2]宋英攀，冯苗，詹红兵．石墨烯纳米复合材料在电化学生物传感器中的应用[J]．化学进展，2012，15(9)：1665-1673．

[3]欧阳瑞镯．聚焦2011年度中国期刊基于功能纳米材料的生物传感器的研究进展[J]．分析化学，2012，40(12)：1938-1944．

[4]Sen AR,Naveena BM,Muthukumar M,et al.Colour,myoglobin denaturation and storage stability of raw and cooked mutton chops at different end point cooking temperature[J].J Food Sci Technol,2014,51(5):970-975.

[5]谷广哲，董社英，黄廷林，等．基于中空氧化镍纳米微球和离子液体复合膜固定血红蛋白的NaNO2生物传感器[J]．高等学校化学学报，2012，15(9)：1926-1931．

[6]张谦，张玲，李景虹．石墨烯及其复合材料在酶电化学生物传感器中的应用[J]．分析化学，2013，41(5)：641-649．

[7]王学亮，郁章玉，焦奎．纳米材料在电化学生物传感器中的应用及纳米仿生界面的构建[J]．理化检验:化学分册，2012，12(5)：621-628．

[8]冯晓苗，李瑞梅，杨晓燕，等．新型碳纳米材料在电化学中的应用[J]．化学进展，2012，18(11)：2158-2166．

[9]黄春芳，姚桂红，邱建丁．表面分子印迹磁性纳米粒子的制备及其血红蛋白传感应用[J]．电化学，2014，12(6)：521-526．

[10]宋娟，顾斌，李鑫，等．纳米材料应用于氧化还原蛋白质直接电化学的研究进展[J]．材料导报，2012，6(S1)：14-18．

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.045

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)10-1404-03

(收稿日期：2016-01-03)