体内诱导抗原技术研究进展

周晏丞,郭玉洁,陈　露,曹立亭,马　跃

(西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌 402460)



体内诱导抗原技术研究进展

周晏丞,郭玉洁,陈露,曹立亭,马跃

(西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌 402460)

摘要:体内诱导抗原技术(IVIAT)作为一种新兴的体内诱导基因筛选技术，相比其他筛选技术具有不需要动物模型的显著优势。大量试验证实体内诱导基因可能与病原微生物在机体内生存以及致病性相关，同时其表达产物也是良好的药物靶标和疫苗候选基因。论文综述了IVIAT的原理、操作步骤及优缺点，由于现阶段该技术在寄生虫病上应用较少，因此分析了其在寄生虫病上所具有的优势和可能存在的问题。

关键词:体内诱导抗原技术；体内诱导基因; 寄生虫病

针对细菌病原学和遗传学的研究在20世纪大部分时间里多集中在体外试验上，而对细菌在体内的作用机制模棱两可。微生物对机体的致病作用是通过多种方式完成的，是两者之间的一个繁杂的多因子作用过程，其一是病原菌释放毒力因子侵袭机体，其二则是机体通过各种防御机制抵御这些毒力因子的作用。由于机体内环境和体外培养条件截然不同，基因表达情况也就存在很大差异，同时病原微生物为了适应环境变化，会通过调节相应基因的表达模式作出适应性反应，即上调在宿主体内存活中起关键作用的基因、表达感染宿主所必需的基因,以及下调某些非必需基因的表达[1]，以优化生存能力。对上述在体内表达而体外培养时不表达的基因进行探求，可增进对致病菌在机体内部生存和致病机理的认知。因此有学者提出以下概念：病原菌感染机体后，在机体内被诱导表达的基因就称为体内诱导基因(invivoinduced gene，ivi gene)。体内诱导基因有可能是病原微生物感染过程中的毒力基因，往往能增强其在宿主体内的生存能力、致病性，甚至决定其毒力强弱[2]，其表达产物同时也可以是非常好的药物靶标和保护性抗原[3]。毒力基因在宿主体内的调控表达过程一定程度上反应了不同感染阶段的环境变化，但由于技术限制，还不能完全模拟病原微生物不同感染阶段宿主内环境的复杂变化，因此并非所有毒力基因都可以在体外被鉴定。为了解决这一问题，体内表达技术(invivoexpression technology,IVET),信号标签诱变技术(signature-tagged mutagenesis,STM)，差异荧光诱导技术(differential fluorescence induction,DFI)，体外转座进行基因组分析和作图技术(GAMB IT)等许多先进技术应运而生，用于在体内鉴定病原菌毒力因子。但是这些技术同时也具有一些缺陷，如这些技术都依赖于动物模型。目前并没有良好的动物模型可用于所有的体内诱导基因筛选，如肺炎链球菌、结核分支杆菌、伤寒沙门菌至今没有合适的动物模型，即便是有，由于感染阶段的复杂多样性，动物模型所模拟的内环境也和宿主体内有一定差异，会使筛选结果产生一定的偏差，同时从动物模型推至人得到的结果也并不一定可靠。近年来提出的体内诱导抗原技术(invivoinduced antigen technology,IVIAT)则是上述技术的很好补充。目前，IVIAT 已经在禽支原体、流产布鲁菌、霍乱弧菌、创伤弧菌等多个病原菌的体内诱导基因筛选中得到了广泛的运用。IVIAT可以在在体状态下鉴定毒力基因，利用该技术作为一个平台来研究在体表达的具有抗原特异性的毒力因子，可以为之后筛选有效的抗原基因，制备高效的动物疫苗奠定基础。

1体内诱导抗原技术的原理

Handfield M等[4]在2000年口腔放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)研究中首次提出IVIAT。该技术不需要依赖于动物模型，而是使用实际感染患者的血清来指示病原菌在体内的基因表达情况。IVIAT是利用康复期病人的血清作为探针吸附病原菌，以此除去菌体体外表达的抗原，只余下感染阶段在机体内部诱导表达抗原，从而检测出体内特异性表达的基因。

IVIAT的操作主要包括以下几点：

首先是病原菌文库的构建。提取病原菌全基因组，用内切酶(Sau3AI)部分消化后，回收0.5 kb~1.5 kb片段(也有文献报道3.5kb的片段也较为有效[5]，插入较大的片段可能不受IPTG诱导，而由原始或局部的启动子引导表达)，将片段与合适的载体(常用pET30-a/b/c)连接，再将连接后的重组质粒转化入大肠埃希菌Dpα中获得含有重组子的克隆，洗脱后重新转化入BL21(DE3)中,使用改良后的BL21(DE3)codon plus菌株可以降低密码子偏好性的影响，检测插入率与片段大小，作为基因组表达文库。

其次是康复期血清的处理。收集多个康复期宿主的血清混合，5个~8个是消除免疫差异的最佳组合，同时应注意感染病人的代表性，样品最好包括不同发病阶段及不同途径感染病人的血清。用体外培养的病原菌全菌体、超声裂解物、热变性裂解处理物对混合血清进行多次(6次以上)吸附，扣除体外培养表达的抗体。由于大肠埃希菌感染的普遍性，宿主血清中不可避免的含有大肠埃希菌的抗体，造成筛选的假阳性。因此，同时需要用文库载体菌的全菌体和细胞裂解物以及热变性裂解物对血清吸附1次~2次，以除去假阳性的可能。注意应在宿主血清中加入复合蛋白酶抑制剂，以充分消除细菌培养物中蛋白酶对血清中抗体的降解。

第三步是文库的免疫筛选。将上述构建的文库标记转印到NC膜上，用吸附处理过后的血清进行多次菌落免疫筛选，获得显色明显的阳性克隆。对筛选出的阳性克隆插入序列进行测序，并对测序结果进行分析比对，即可得到编码该致病菌体内表达抗原的基因序列。因为体内诱导表达的抗原基因在体外是不转录的，用RT-PCR技术对阳性克隆进行再次验证，可以保证克隆结果的正确性[6]。

2IVIAT的应用

自IVIAT问世以来，已成功运用于病原菌感染人体后，在机体产生的体内诱导抗原基因的筛选研究中。同样，在动物病原菌研究方面，也有越来越多的报道。

2.1IVIAT在人类疾病方面的应用

Deb D K等[7]在2002年构建了结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)p7Rv基因组文库，利用结核病康复期病人的血清吸附体外培养的p7Rv菌株，共筛选出6个在体诱导表达基因，其中rv0287、rv387、rv2402和rv1045为假想功能蛋白，在数据库中并未发现与其高度同源的序列，dnaQ(rv3711c)负责编码具有校对功能的DNA聚合酶Ⅲ的小部分亚基，lpdA(rv3303c)负责编码二氢硫辛酰胺脱氢酶。研究发现这2种酶都可能是潜在的药物靶标，为后续结核病的治疗提供了方向。Long Hang等[8]采用IVIAT研究了霍乱弧菌(Vibriocholerae)的体内诱导基因。该菌为革兰阴性菌，能够引起人类发热、腹泻，严重时可因脱水引起死亡。他们首先构建El Tor N16961 O1株基因组表达文库，分离10个康复期病人血清，用体外培养的El Tor 霍乱弧菌O1菌体进行吸附，作为后续筛选探针。试验共筛选出38株阳性克隆，分别编码4号菌毛PilA和TcpA(毒素共调节鞭毛)，细胞膜蛋白PilQ、MshO、MshP和CapK，三甲基趋化蛋白，传感蛋白LuxP等。对纯化的PilA和TcpA进行免疫反应试验，结果发现PilA及其胞外分泌产物PilQ在感染阶段均有表达，并且能够在胃肠道定殖，而TcpA能够与吸附后的血清发生稳定的免疫反应，证明了TcpA在人体内的反应原性，说明利用IVIAT不仅可以快速筛选出体内诱导基因，同时这些毒力基因表达产物还具有潜在的研究价值。Dantas S F I M等[9]通过IVIAT筛选了Paracoccidioidesbrasiliensis的体内诱导基因，该菌能引起人类系统性肉芽肿，即副球孢子菌病。利用11个康复期病人的血清吸附cDNA文库，经过三轮筛选从近6 000个克隆中共筛选出35个阳性克隆，包括负责细胞代谢的脂酰辅酶A脱氢酶(acyl-coA dehydrogenase)、芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic-L-amino acid decarboxylase)、辅酶Q(ubiquinone COQ9)等功能蛋白以及6个功能未知蛋白。副伤寒沙门氏菌(Salmonellaentericaserotype paratyphi A)能够引起人类的持续发热、肝脾肿大、腹泻。Alam M M[10]利用IVIAT从100 000个克隆中初筛出505个阳性克隆，复筛后获得仅在体内表达的阳性克隆47个，包括87个全部或部分沙门氏菌ORF片段，将该ORF亚克隆入pET30，电转后得到20个克隆。分析其ORF，包括涉及编码菌毛结构(SPA0021、SPA0181、SPA0201、SPA0703)、细胞膜(SPA1533、SPA1604、SPA1645、 SPA3787和SPA4148)、细胞新陈代谢和凋亡进程(SPA0489、SPA0608、SPA0652、SPA1239、SPA1734、SPA2362、SPA2948和SPA4117)等多个功能的基因。

可见IVIAT在引起人类疾病的病原微生物中应用较广，研究较为全面，能够快速筛选出体内诱导基因，同时该基因的产物也是很重要的毒力因子。对这些毒力因子进行系统的研究，有助于之后对该疾病的预防、控制及治疗。

2.2IVIAT在家禽疾病方面的应用

IVIAT首先运用于口腔放线杆菌，而后广泛运用于动物疾病中，对家禽疾病研究进行了补充。我国鸭疫里默杆菌的流行血清型以血清1型为主，缺乏对里默杆菌(Riemerellaaanatipestifer，RA)体内诱导基因的研究报道。袁建丰等[11]建立了RA菌株血清1型的基因组文库，用血清探针进行吸附，以期获得特异性表达的体内毒力基因，初筛共获得23个阳性克隆，复筛得到14个，其中2个为重复筛选获得，为后续的鉴定分析奠定了基础。副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)是一种革兰阴性菌，能够使鸡生长发育受阻，引起淘汰率增加、产蛋率下降、肉鸡品质降低等，进而影响家禽业生产。梁玉荣[12]经过多轮筛选试验最终从副鸡禽杆菌基因组文库中确定了5个ORF，1个编码为转运谷氨酰还原酶，1个为转录终止因子和荚膜合成域2基因簇，另外2个编码保守假想蛋白。李求春[13]对鸡白痢沙门菌S06004基因组进行2轮筛选，共获得45个基因，进行比对分析后发现，可分为几大类：生物大分子的合成和降解(嘧啶合成相关的 pyrB、氨基酸合成相关的 dapA)、能量代谢相关分子(乙酰辅酶 A 脱氢酶 adhE、四氢乙酸合成相关的 folE等)、膜转运蛋白、调控因子、抗生素抗性蛋白及噬菌体相关蛋白和功能未知功能蛋白等，筛选得到的蛋白覆盖细菌各个方面，反映细菌在体内除了感染和致病，同时也要保证其生存的基本要素，同时该结果和其他文献结果基本一致，证明亲缘关系较近的细菌在感染致病的过程中有一定的相似性。

2.3IVIAT在家畜疾病方面的应用

猪链球菌病是由猪链球菌Ⅱ型(Streptococcussuisserotype 2，SS2)引起的，可引起猪的多种疾病,侵害各年龄阶段的猪, 通常以败血症、脑膜炎、关节炎 、 淋巴结炎为主要特征,还可引起人类脑膜炎、败血症等,导致严重疾患，甚至死亡[14]。通过传统基因工程技术和生物化学方法很难了解其在体内感染的复杂过程。2009年，Gu H等[15]构建了ss2基因表达文库，采用康复期猪血清进行吸附，筛选到48个阳性克隆，其中40个为已知功能蛋白，另外8个为未知功能蛋白。对10个已知功能蛋白进行RT-PCR鉴定，结果显示在在体环境中，有6个基因表达上调。通过传统基因工程技术和生物化学方法很难了解猪链球菌在体内感染的复杂过程，IVIAT能够在在体环境下鉴定毒力基因则弥补了该弊端。Ma Z等[16]在2015年构建了兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus，SEZ)ATCC35246的基因组表达文库，以感染家猪的康复期血清为探针，筛选分析了43组体内表达基因，涉及了SEZ毒力基因、中间产物的形成、基因复制、转录和表达等多个方面。因此，运用IVIAT可以为研究病原菌的致病机理、疾病的诊断、疫苗的开发等提供一种新的方法。

2.4IVIAT在野生动物疾病、鱼病等方面的应用

IVIAT不需要动物模型、无需知道病原菌的遗传背景的优势使得该技术在其他动物疾病中也得到了良好的发展。炭疽杆菌能够引起猪、马、牛、羊等家畜甚至人类的炭疽病。2008年，Rollins S M等[18]以猕猴为感染宿主，利用大肠埃希菌BL21(DE3)构建了炭疽杆菌基因表达文库，在近125 000个克隆中成功筛选出60个阳性克隆，其中包括聚乙酰谷氨酸，酰胺酶自溶素家族的7个成员，2个转运子以及3个未知功能蛋白等。Lowry J E等[19]对自然感染 B 型流产布鲁菌(BrucellaabortusB)的麋鹿进行了研究，最终获得了 B 型流产布鲁菌的3种体内表达蛋白外膜蛋白(D15)、苹果酸脱氢酶(MDH)和离子转运体(AfuA)。维氏气单胞菌(Aeromonasveronii，AV)是近年来发现的一种人-兽-鱼共患病病原，主要引起败血症、脑膜炎、胃肠炎等。康元环[20]对AV CVCC3700基因组用IVIAT进行筛选，获得21个基因序列，共含有22个ORF(其中一个基因含有2个完整ORF)，其功能主要涉及分子生物合成和降解相关基因(7个)、转录调控基因(MarR和AraC转录调控[21])、细胞壁合成相关基因(3个)、转运相关基因(包括 ABC 转运子通透酶，生物大分子转运体 TonB 及外膜受体介导的转运激发蛋白质 Ton B等[22])、裂解基因(1个)、调节基因(2个)、分泌系统相关基因(1个)和未知功能基因(3个)。Jiao X等[23]利用IVIAT从患病鱼体内分离得到迟缓爱德华菌(Eswardsiellatarda)菌株 TX01，从中筛选得到3个抗原蛋白：Eta21、Eta6 及 FliC，并通过牙鲆对3种抗原蛋白进行了研究，结果发现，重组蛋白 Eta21 可以有效地保护牙鲆抗迟缓爱德华菌感染；Zou Y X等[24]以大菱鲆为感染动物，在鳗弧菌(Vibrioanguillarum)中获得了 19 个假定的体内诱导基因。

2.5IVIAT在寄生虫病方面的应用

现阶段，IVIAT应用多集中于细菌毒力基因的检测，并且以感染人类的病原微生物为主，随着动物医学的快速发展，近年来在动物病原菌方面的研究应用逐渐增多，但在寄生虫方面的研究报道仍然比较缺乏。其中Tao Q等[17]构建了刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)的基因组文库，筛选获得了14个阳性克隆，鉴别分析其同源性及功能，发现包括编码细菌侵袭(PI、CyP、GRA5、MIC11)，离子/蛋白结合(CaM和LRRP)，生物合成和新陈代谢(D4PD和 EF1)以及6个已知功能基因。其中5个高表达基因分别是钙调蛋白基因(CaM)JK483883、亲环素基因(CyP)JK483893、丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(PI)JK483886、致密颗粒蛋白5基因(GRA5)JK483900以及微线体蛋白11(MIC11)JK483892。以上5个基因功能与弓形虫侵染机体的过程有关，预示着体内诱导基因在寄生虫感染阶段扮演着非常重要的角色。

可想而知利用IVIAT筛选寄生虫体内诱导抗原基因将会是寄生虫抗原组研究的新方法。以鸡柔嫩艾美耳球虫为例，球虫生活史包括3个发育阶段，即孢子生殖阶段、裂殖生殖阶段和配子生殖阶段。不少学者利用各种方法筛选到部分柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的保护性基因，但只是某一阶段的某单一抗原，缺乏对其所有抗原(抗原组)的系统化研究，从而导致市面上具有免疫效力的疫苗临床保护效果均不理想。因此，利用IVIAT筛选出不同病程阶段的不同抗原组，对每个阶段均有表达的保护性基因进行深入研究，制成具有完全保护力的疫苗，或者将不同病程阶段表达的基因重组制成联合疫苗，使其具有高保护力。但目前除弓形虫外，还未有相似研究，笔者认为最主要的原因是就免疫方面而言，寄生虫不如细菌引起的免疫反应显著，用以做探针的血清抗体滴度较低，而IVIAT又是基于抗原抗体反应基础上的，因此给该技术在寄生虫方面的大量应用带来了困难。

以鸡柔嫩艾美耳球虫为例，球虫生活史包括3个发育阶段：孢子生殖阶段、裂殖生殖阶段和配子生殖阶段[25]。不少学者利用各种方法筛选到部分柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的保护性基因，但只是某一阶段的某种单一抗原，缺乏对其所有抗原(抗原组)的系统化研究，从而导致市面上具有免疫效力的疫苗临床保护效果均不理想。因此，利用IVIAT筛选出不同病程阶段的不同抗原组，对每个阶段均有表达的保护性基因进行深入研究，制成具有完全保护力的疫苗，或者将不同病程阶段表达的基因重组制成联合疫苗，使其具有高保护力。但目前除弓形虫外，还未有相似研究。笔者认为最主要的原因是就免疫方面而言，寄生虫不如细菌引起的免疫反应显著，用以做探针的血清抗体滴度较低，而IVIAT又是基于抗原抗体反应基础上的，因此给该技术在寄生虫方面的大量应用带来了困难。但利用IVIAT筛选寄生虫体内诱导抗原基因将会是寄生虫抗原组研究的一种新方法。

3IVIAT的优势与不足

常见筛选诱导抗原基因的技术有体内表达技术(IVETI),信号标签诱变技术(STM)，差异荧光诱导技术(DFI)，体外转座进行基因组分析和作图技术等。IVET是基于启动子诱捕策略的体内表达技术，将一定大小的病原基因随机片段克隆到缺乏启动子的报告基因中，构建含有病原随机基因组片段和报告基因的融合载体(即启动子诱捕文库)，再转化宿主菌，得到重组病原菌。在感染动物模型后，这些重组病原菌会表现出报告基因的相应表型，最后筛选出含有报告基因的表型，从而鉴定出体内诱导表达的基因。该技术无法鉴定出瞬时表达或表达丰度较低的体内诱导基因。

信号标签突变技术(STM)是基于转座子特性发展起来的新型筛选技术，是将穿梭性转座子诱变技术和基因融合策略联合应用以鉴定细菌在不同生长环境及不同致病条件下的必需基因。

差异荧光诱导技术(DFI)同IVET相似，同样也采用启动子诱捕策略，不同之处在于DFI需要以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因来分离能驱动GFP基因表达的体内诱导基因序列，而IVET根据报告基因的不同分为营养缺陷型筛选、抗生素抗性筛选、依赖于重组酶的筛选和系统特异性筛选4种类型。

上述多种方法都已广泛应用于病原菌分子遗传学的研究，但是它们都有同样的缺点，即需要动物模型，同时操作比较复杂。最重要的是现阶段很多病原菌缺乏相应的合适动物模型。即使有，疾病是机体和病原菌相互作用的一个复杂过程，动物模型并不能很好的反应机体的内部情况，在这种情况下，IVIAT的优势就显而易见：①不依赖于动物模型，操作简单方便，能够反应机体内部的真实情况，对研究病原菌不同时期对机体产生的抗原提供了平台，并且混合血清的使用最大限度的减小了个体免疫差异；②可以对瞬时表达的基因进行检测，可以高通量的对多个克隆进行筛选；③无需了解病原菌的生物学背景和遗传学资料，对突发病原菌和目前了解不多的病原菌尤其适用；④通过免疫杂交反应筛选出的基因可以作为潜在的药物靶标和疫苗候选抗原。

IVIAT同样存在缺点，首先该技术只适用于能够在体外培养的病原菌，不能应用于无法在体外诱导培养的病原菌；其次，利用血清作为抗体探针，无法检测细胞免疫情况；再者，该技术只能识别在体内表达的基因，不能识别病原菌所表达的所有毒力因子；另外，利用大肠埃希菌构建文库也可能面临密码子偏好性、酶切位点限制和毒性抗原的过表达[26]，大肠埃希菌不能表达的基因也无法检测；最后，IVIAT建立于菌落免疫筛选技术基础上，血清探针中抗体的强弱对筛选结果有一定影响，无法筛选编码没有免疫原性的体内表达基因，低免疫原性抗体会降低筛选特异性，同时交叉免疫则可能造成假阳性。但需要注意的是，交叉反应不代表该基因就一定不在体内表达，同样有表达也不代表有保护力。

4结语

IVIAT作为一种新兴的体内诱导基因筛选技术，具有独特的优势，尽管其也具有一定的局限性，但仍是一种鉴定体内诱导基因的有效技术。利用该技术筛选出的毒力因子可以作为可能的药物靶标、疫苗候选基因等，为后续研究奠定基础。同时应用该技术还可能填补寄生虫抗原组研究的部分空白，有巨大的潜在应用价值。

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Progress oninVivoInduced Antigen Technology

ZHOU Yan-cheng，GUO Yu-jie，CHEN Lu，CAO Li-ting，Ma Yue

(DepartmentofVeterinaryMedicine,SouthwestUniversity，RongchangCampus,Chongqing, 402460，China)

Abstract:In vivo induced antigen technology (IVIAT), as a new technology in vivo induced gene screening, has significant advantages that surpasses other screening technologies, namely it doesn't need animal models. Numerous experiments confirmed that the in vivo induced genes may have a subtle relationship with the survival and pathogenic microorganismsy, and its expression products are also a well-functioned kind of drug target and the candidates of vaccine genes. This paper summarized the principles, steps, advantages and disadvantages of IVIAT,at the present stage, with only a small quantity of application on parastic diseases based on IVIAT, the advantages of IVIAT on parastic disease and the potential problems were analyzed in the paper.

Key words:in vivo induced antigen technology; in vivo induced gene; parasitic disease

文章编号:1007-5038(2016)02-0075-06

中图分类号:S852.43

文献标识码:A

作者简介：周晏丞(1991-)女，重庆江北人,硕士，主要从事畜禽传染病与寄生虫病防治研究。

收稿日期：2015-06-09