TIMP2在激素性股骨头坏死中作用的实验研究

纪志华，贾丙申，于鹏，周立义，付昆，李洪潮，李君，周建强，李明，云大科，胡帅(海南医学院附属医院关节创伤外科，海南 海口 570102)

·论 著·

TIMP2在激素性股骨头坏死中作用的实验研究

纪志华，贾丙申，于鹏，周立义，付昆，李洪潮，李君，周建强，李明，云大科，胡帅(海南医学院附属医院关节创伤外科，海南 海口 570102)

目的 观察激素性股骨头坏死组织中基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP2)的表达情况，探讨TIMP2在激素性股骨头坏死中的作用机制。方法采用12只家兔，按照随机数表法分为对照组和模型组，每组6只。模型组给予静脉注射10µg·mL-1·kg-1内毒素和肌肉注射40 mg/kg甲基强的松龙，对照组给予等量的生理盐水。10周后进行X线、CT等检查，比较两组家兔的股骨头标本空骨陷窝率、髓腔脂肪面积及TIMP2表达。结果模型组家兔的空骨陷窝率为(20.26±9.83)%，髓腔脂肪面积为(236.30±34.78)µm2，X光可见股骨头内骨小梁稀疏，断裂，密度不均匀等坏死表现，TIMP2的阳性表达率为10.5%，而对照组则分别为(3.12±1.05)%、(178.80±21.82)µm2和30.5%，两组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论激素性股骨头坏死组织中的TIMP2的低表达与股骨头坏死发生有密切关系。

激素性股骨头坏死；组织基质金属蛋白酶抑制剂；骨小梁

激素性股骨头坏死(glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head，GNFH)是一种常见病，好发于中青年人，发病年龄在30～59岁，严重影响到人民群众的身体健康[1]。基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinase，MMPs)是参与全身各种组织，包括骨组织降解的蛋白酶家族，而组织基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metallo-proteinase，TIMPs)对MMPs具有明显的调节作用，在TIMPs存在的情况下，破骨细胞的骨吸收作用明显被抑制[2]。本研究采用内毒素加激素的方法制作激素性股骨头坏死模型，通过免疫组化的方法检测TIMP2的表达，探讨TIMP2在激素性股骨头坏死中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物 海南医学院动物试验中心提供家兔12只，雌雄各半，平均体质量(3.7±0.3)kg。按照随机数表法分为对照组和模型组，每组6只。

1.2 主要仪器与试剂 奥林巴斯显微镜，武汉博士德生物公司TIMP2试剂盒，比利时辉瑞公司甲基强的松龙500 mg，Sigma公司大肠杆菌内毒素10 mg。

1.3 模型制作 家兔左侧耳缘静脉注射内毒素l0µg·mL-1·kg-1。随即在左臀部按照40 mg/kg注射甲基强的松龙一次，右侧臀部注射青霉素钠40万U一次预防感染。连续3 d。对照组在相同注射部位注射等量的生理盐水。

1.4 影像学检查及组织取材 10周后，家兔麻醉后行X光和CT检查，见图1。影像学检查完毕后麻醉过量法处死动物，无菌操作，取出股骨头，剔除软组织，大体观察股骨头形态并记录。再以冠状面剖开股骨头，甲醛固定、硝酸脱钙、酒精脱水、石蜡包埋、切片及HE染色等处理后置于光镜下，观察骨小梁、成骨细胞、破骨细胞、骨髓脂肪细胞等形态和结构改变。并计算：①空骨陷窝率：每张切片在高倍镜下任选10个视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别计数其中空骨陷窝数，计算空骨陷窝率(空骨陷窝率=空骨陷窝数/ 50×100%)。②髓腔脂肪组织面积：任选5个高倍视野，采集图像软件定量分析，测量髓腔脂肪组织面积。

图1 模型组X光及CT

1.5 免疫组化检测 采用TIMP2试剂盒检测TIMP2。

1.6 统计学方法 应用SPSS20.0统计软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组家兔的一般情况比较 造模3周后动物逐渐出现饮食减少，精神不振，体质量下降，并死亡1只。模型组股骨头X线，CT及HE染色可见骨小梁稀疏，断裂，碎片化及空骨陷窝形成，符合激素性股骨头坏死的病理表现，见图2。

图2 HE染色(×100)

2.2 两组家兔的空骨陷窝率和髓腔脂肪面积比较 模型组的空骨陷窝率和髓腔脂肪面积均明显高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

组别对照组模型组t值P值样本量6 6空骨陷窝率(%) 3.12±1.05 20.26±9.83 -6.38＜0.05髓腔脂肪面积(μm2) 178.80±21.82 236.30±34.78 -7.88＜0.05

2.3 两组家兔的TIMP2表达情况比较 经过图像分析处理后，TIMP2在模型组每百个视野的阳性表达率为19.5%，而对照组为30.5%，模型组明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 TIMP2染色(×100)

3 讨 论

TIMPs是MMPs的天然内生抑制剂，TIMP2对MMPs家族具有广泛的抑制作用，但主要抑制MMP2，同时抑制Ⅳ型胶原的降解[3]，并且可以调节骨基质降解的速度和数量[4]。此外，TIMP2存在的情况下，破骨细胞的骨吸收作用明显被抑制[5]。MMPs属细胞内蛋白水解酶家族，需要钙离子、锌离子等金属离子辅佐才能发挥作用，故而命名。其是参与细胞外基质降解的必需酶，根据其作用底物和结构的不同分为胶原酶，明胶酶、基质溶解素、膜型金属蛋白酶等。其中MMP2属于明胶酶，可降解各型胶原，粘连蛋白，蛋白多糖等[6]，直接参与骨基质降解，在骨代谢疾病中发挥重要作用。

本研究观察到模型组空骨陷窝率明显高于对照组(P＜0.05)，髓腔脂肪面积也明显高于对照组(P＜0.05)。因此笔者认为，此造模方法使兔股骨头髓腔内脂肪明显增多，骨坏死明显增多，符合股骨坏死的病理学表现，因此模型是成功的。模型组的TIMP2阳性表达明显低于对照组(P＜0.05)，说明TIMP2的低表达与激素性股骨头坏死的发生具有密切关系。

综上所述，激素性股骨头坏死的发生与TIMP2的低表达有密切关系。超量的糖皮质可能通过作用于TIMP2，减少对MMP2的抑制作用，从而激活骨吸收的过程，导致股骨后坏死的发生。由于本研究经费的限制，样本量偏小，可能存在一定的实验误差，需要进一步验证。

[1]Whittier X,Saag KG.Glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Rheum Dis Clin NorthAm,2016,42(1):177-189.

[2]Collazos J,Asensi V,Martin G,et al.The effect of gender and genetic polymorphisms on matrix metalloprotease(MMP)and tissue inhibitor(TIMP)plasma levels in different infectious and non-infectious conditions[J].Clinical and Experimental Immunology,2015,182(2): 213-219.

[3]Prideaux M,Staines KA,Jones ER,et al.MMP and TIMP temporalgene expression during osteocytogenesis[J].Gene Expr Patterns, 2015,18(1-2):29-36.

[4]Anne K,Sundeep K,Paul K.RANKL and OPG regulation of bone remodeling in health and disease[J].Endocrine Reviews,2008,29(2): 155-192

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[6]Glueck CJ,Freiberg RA,Boppana S,et al.Thrombophilia,hypofibrinolysis,the eNOS T-786C polymorphis，and multifocal osteonecrosis[J].J Bone Joint SurgAm,2008,90(10):2220-2229.

Experimental study on the roles of TIMP2 in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head.

JI Zhi-hua,JIA Bing-shen,YU Peng,ZHOU Li-yi,FU Kun,LI Hong-chao,LI Jun,ZHOU Jian-qiang,LI Ming,YUN Da-ke,HU Shuai.Department of Joint Trauma Surgery,Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102, Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the expression of matrix metallo-proteinase inhibitor-2(TIMP2)and its roles in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head(GNFH).MethodsTwelve rabbits were randomly divided into control group and model group according to random number table,with 6 rabbits in each group.The model group was given intravenous injection of endotoxin(10µg·mL-1·kg-1)and intramuscular injection of methylprednisolone(40 mg/kg),while the control group was given equal amount of saline.The rabbits were examined by X ray and computed tomography(CT)10 weeks later.The rates of empty bone lacuna,fat area of medullary cavity and TIMP2 expression of femoral head specimens were observed and calculated.ResultsThe rate of empty bone lacuna,the fat area of medullary cavity,the positive expression rate of TIMP2 were(20.26±9.83)%,(236.30±34.78)μm2,10.5%,respectively in model group,which were significantly higher than those in control group of(3.12±1.05)%,(178.80±21.82)μm2,30.5% (P＜0.05).X ray showed necrosis manifestations of sparse bone trabecula in the femoral head,fracture and uneven density in model group.ConclusionLow expression of TIMP2 in GNFH is closely related to the occurrence of GNFH.

Glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head(GNFH);Tissue inhibitor of metallo-proteinase;Bone trabecula

R-332

A

1003—6350（2016）18—2925—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.001

2016-06-20)

海南省自然科学基金(编号：814357)

贾丙申。E-mail：jbs123@163.com