基因疫苗黏膜免疫及其机制的研究进展

秦妍 管晓燕,2 综述 白国辉,2 刘建国,2 审校

(1.遵义医学院口腔医学院，贵州 遵义 563099；2.贵州省高等高校口腔疾病研究特色重点实验室遵义市口腔疾病研究重点实验室，贵州 遵义 563099)

基因疫苗黏膜免疫及其机制的研究进展

秦妍1管晓燕1,2综述 白国辉1,2刘建国1,2审校

(1.遵义医学院口腔医学院，贵州 遵义 563099；2.贵州省高等高校口腔疾病研究特色重点实验室遵义市口腔疾病研究重点实验室，贵州 遵义 563099)

基因疫苗； 黏膜免疫； 分泌型免疫球蛋白； 免疫佐剂

基因疫苗是将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体质粒上，然后将重组质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。以达到预防疾病的目的。现已证实基因疫苗的有效性及安全性，但存在人体不能对基因疫苗进行有效的吸收以及机体对抗原的免疫耐受等不足，使其在人体中的免疫效果不佳。近年来，对基因疫苗的免疫策略、免疫效果及作用机制已进行了大量的研究。肌肉注射法因外源基因在体内的表达水平较低，免疫效果不够理想。基因枪法、电穿孔等递送技术的发展均显著提高了基因疫苗的活体递送效率，使基因疫苗免疫具有较强的诱导免疫应答的能力[1-2]。

口服、鼻腔黏膜滴注等黏膜免疫途径因其给药安全方便，价钱便宜，安全等优点[3]已受到广泛关注。基因疫苗的黏膜免疫途径不同，所产生的免疫应答强弱也不同。本文就基因疫苗的黏膜免疫的效果及其机制研究现状做一综述。

1 基因疫苗的黏膜免疫

黏膜免疫系统(MIS)是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺体(唾液腺、泪腺、乳腺)处的淋巴组织，这些淋巴组织提供了天然的保护，防止病原体从机体表面进入，减少病原体散布到黏膜下组织、局部淋巴结、血液中。因此，黏膜免疫系统是机体抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障，同时，黏膜免疫系统也是免疫系统中最大的部分，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。

近年关于黏膜免疫的前沿研究提示,诱导黏膜局部免疫应答,将比常规的全身免疫更有助于清除黏膜感染病原体,预防感染的扩散和慢性化[4]。因此，基因疫苗研究的热点主要在黏膜免疫。基因疫苗的黏膜免疫一般是将基因疫苗通过表面涂布或基因枪介导等方法进行免疫。致敏的淋巴细胞通过淋巴细胞归巢，大约80%淋巴细胞再次返回到致敏的黏膜部位发挥免疫功能，即存在局部黏膜免疫反应[5]。另外，大约20%的淋巴细胞会进入其它黏膜部位参与其效应反应，称共同黏膜免疫系统(CMIS)[6]。

基因疫苗接种后还可以诱导长期的免疫记忆[7]，许庆安等[8]在靶向防龋基因疫苗pGJA-P/VAX经鼻黏膜滴注途径免疫BALB/c小鼠的实验中证实，基因疫苗可在免疫原位和引流淋巴结存在6个月。

1.1 鼻腔滴注免疫 人类鼻黏膜免疫组织为韦氏环。鼻内pH值为6.5～7.0，鼻黏膜有很高的不规则度，其表面上皮细胞的微绒毛，提供了很大的膜面积，能提高鼻黏膜的吸收效率。且鼻腔中酶的活性和种类小于胃肠道，相较口服而言，基因疫苗不易受到酶的降解。据文献[9]报道,与口服免疫相比，抗原经鼻黏膜免疫的剂量为口服免疫剂量的四分之一，即鼻黏膜诱导免疫应答的抗原量低于口服免疫[10]，因此鼻黏膜免疫仍是研究的热点。基因疫苗通过鼻腔滴注的方式免疫不仅能有效的诱导机体产生系统免疫和局部黏膜免疫反应[11]，同时，在鼻黏膜免疫中，由于抗原特异性淋巴细胞分布在机体共同黏膜免疫体系中，故可诱导产生共同黏膜免疫反应[12]。受抗原刺激后鼻黏膜免疫反应过程大致如下：鼻黏膜在抗原的刺激下，会启动局部免疫调节，IgA沿上皮层弥散定居于黏膜下层各位点。同时，IgA阳性B细胞在抗原刺激下迅速由黏膜下淋巴管进入血液循环，受Th-2的调节，发育分化增殖后，移动到黏膜固有层(LP)中成为成熟IgA浆细胞和分泌型IgA浆细胞。继而与上皮细胞表面上具有抗菌性能的分泌片段(SC)结合成为分泌型IgA(SIgA)，SC保护SIgA不被蛋白水解酶降解。随后SIgA经上皮细胞转运至上皮表面，并分泌到外分泌液中，与上皮细胞紧密结合，分布在黏膜表面发挥效应[13]，成为特异性免疫球蛋白抵抗外界抗原的第一道防线，其中除SIgA通过阻止黏附、溶解细菌、中和病毒、介导ADCC等机制从而为黏膜表面提供一个免疫屏障外，还可作为黏膜免疫疫苗的携带者，提供安全稳定的疫苗传递系统[14]。

SIgA是机体内分泌量最多的免疫球蛋白[15]，占黏膜相关组织产生的所有抗体的80%。而一般DNA疫苗经肌肉注射、皮内注射等途径接种, 能产生高滴度的特异性IgG，但IgA水平较低。为更有效抵抗外界刺激，诱导SIgA成为最重要的途径[16]。

尽管鼻黏膜免疫有很多优势，但是由于疫苗在鼻腔内的低渗透性和短暂的停留时间，使基因疫苗不能很好的起到免疫作用。最新研究结果表明：通过壳聚糖包裹基因疫苗可以在黏膜免疫中显著的提高特异性SIgA的富集[17]从而更好的发挥免疫效应，也可以通过微粒系统包裹基因疫苗或表面吸附使被吸附的基因疫苗经鼻黏膜免疫后产生明显高于裸DNA的鼻黏膜免疫应答水平。相较于口服免疫，鼻腔免疫因避免了胃肠道酸性环境及酶对抗原的破坏、操作简便易行而被广泛采用。

1.2 口服免疫 基因疫苗也可以通过口服的方式进入机体发挥免疫应答，口服疫苗简单易行，是最重要的免疫方式之一。M细胞是肠道黏膜免疫组织的功能性入口[18]，它是肠黏膜的诱导部位派伊尔集合淋巴结(PP)中的一种上皮细胞。PP结含有大量的免疫细胞，其中B细胞主要分布在淋巴滤泡，T细胞主要位于淋巴间区，同时也是黏膜免疫的主要诱导部位。有研究[19]证实M细胞的发展在肠内是依靠B淋巴细胞发挥其抗原提呈的作用。Neutra等[20]研究发现M细胞是大分子颗粒抗原进入上皮淋巴组织的主要途径，它能特异性结合肠道大分子物质及微生物并通过受体介导包吞的方式将抗原转运给黏膜下方的淋巴组织，然后抗原提呈细胞加以处理后呈递给T淋巴细胞，同时通过促进Tfh细胞的分化能有效提高B淋巴细胞的活化[21]，B淋巴细胞分化增强，产生大量SIgA，再与B细胞合成IgA二聚体，穿过上皮细胞进入肠腔，启动抗原诱导SIgA特异性黏膜免疫应答后与IgG一起发挥生物学效应[22]，随后通过胸导管进入血液循环，进而到达各效应部位发挥免疫效应。因此，M细胞被称为开启黏膜免疫的门户[18]。

此外，成功的黏膜免疫接种是依靠于将抗原提呈到黏膜免疫诱导位点。APC对激活免疫应答起关键性作用。因此，最新研究[23]证实通过生物的配体选择设备人工培养的M细胞可以作为递送靶抗原进入黏膜免疫系统的一种佐剂来增强免疫诱导。但在胃肠道中，胃酸的水解以及各种酶对基因疫苗的降解可能使基因疫苗过早失活，在机体中不能完全发挥免疫效应。有研究[24]报道,明胶对温度稳定，可冻干，安全而无副作用，作为基因疫苗的佐剂不仅增强免疫应答，而且明胶可上调IgA应答。微粒系统中除了脂质体包裹的基因疫苗的免疫原性得到明显提高，壳聚糖也作为重要的免疫佐剂可以提高抗体水平，增强免疫应答[25]。

1.3 肺部免疫 鼻黏膜免疫可以引发上呼吸道黏膜免疫，但很难诱导下呼吸道的黏膜免疫，通过肺部免疫可以有效抵抗下呼吸道感染。人体无固定的呼吸道相关淋巴组织的结构，但是抗原或者感染状态能够诱导呼吸道相关淋巴组织的形成。肺黏膜薄且血管丰富, 吸收面积达75 m2。在肺黏膜免疫中，基因疫苗显著增强了肺黏膜局部特异性CD4+Th1细胞并诱导SIgA抗体的分泌[26]。水平游离的APC随时可以抵抗外来感染，是肺部基因免疫的靶部位，其中肺部上皮细胞具有抗原递呈的作用[27]。增强系统在黏膜诱导部位的停滞时间，可以增加DNA疫苗进入黏膜免疫组织的效率, 增强诱导免疫应答的效应。但免疫实施不便在呼吸道中，因此相较鼻滴及口服临床应用较少。

2 小 结

基因疫苗通过黏膜免疫的方式诱发机体的免疫应答的应用越来越广泛，不仅是因为黏膜免疫给药方便、安全等特点，而且基因疫苗进入黏膜启动的黏膜免疫应答比全身免疫更易清除黏膜上的病原体、预防机体感染扩散、增强机体抵抗力[28]。因此选择通过不同的黏膜免疫方式进入机体，启动黏膜免疫应答，但为让基因疫苗更完整的到达黏膜上发挥其高效性，需借助佐剂作为载体包裹基因疫苗，使其更完整、安全的到达黏膜表面发挥黏膜免疫效应。但是在黏膜免疫机制中还存在许多问题，如SIgA的高效性是由于其分子的多聚体结构还是SC上额外的抗原决定簇，M细胞对病原体的转运是特异性或非特异性仍然存在争论，M细胞摄取抗原的机制等都尚未明确。

有关肺部免疫的相关机制的文章并不多。若要使基因疫苗更好更快更安全的进入机体通过黏膜免疫发挥其效应，这些问题必须得到解决，也有待进一步研究。

[1] Lu S,Wang S,Grimes-Serrano JM.Current progress of DNA vaccine studies in humans[J].Expert Rev Vaccines,2008,7(2):l75-191．

[2] 肖毅,高昆,杨勇,等.电穿孔技术对DNA疫苗pVAX-tG250FcGB免疫效果的影响[J].基础研究,2013,33(11):1628-1631.

[3] Neutra MR,Kozlowski PA. Mucosal vaccines:the promise and the challenge[J].Nat Rev Immunol,2006,6(2):148-158.

[4] Yuki Y ,Kiyono H.Mucosal vaccines:novel advances in technology and delivery[J].Expert Rev Vaccines,2009,8(8):1083-1097.

[5] 高英杰.黏膜免疫向免疫学提出了新问题[J].上海免疫学杂志,2000,20(5):257-258.

[6] 闫振贵.不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫反应的研究[D].山东农业大学,2011.

[7] Chaves SS,Fischer G,Groeger J,et a1.Persistence of long-term immunity to hepatitis B among adolescents immunized at birth[J].Vaccine,2012,30(9):1644-1649．

[8] 许庆安,樊明文.靶向防龋DNA疫苗在小鼠体内的存留时间分析[J].口腔医学研究,2009,25(1):1-3．

[9] Jiang H L,Kang M L,Quan J S,et al.The potential of mannosylated chitosan microspheres to target macrophage mannose receptors in an adjuvant-delivery system for intranasal immunization[J].Biomaterials,2008,29(12):1931-1939.

[10] 王晶,刘建国,姜晶,等.防龋基因疫苗pcDNA3-PAc兔鼻腔黏膜免疫防龋的实验研究[J].上海口腔医学,2014,23(2):133-137.

[11] 岳朝辉,刘建国,王晶,等.防龋基因疫苗pcDNA3-PAc不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究[J].实用口腔医学杂志,2010,26(2):145-148.

[12] 马金萍,杨树宝,姜咏昊,等.新城疫疫苗滴鼻点眼诱导雏鸡消化道产生共同黏膜免疫反应的研究[J].中国预防兽医学报,2014,36(6):471-474.

[13] 王恩意,谭俊涛,宋桂婷.动物消化道黏膜免疫的研究进展[J].家禽科学,2011,2:47-50.

[14] Jee J,Bonnegarde-Bernard A,Duverger A,et al.Neutrophils negatively regulate induction of mucosal IgA responses after sublingual immunization[J].Mucosal Immunol,2015,8(4):735-745.

[15] Mantis NJ,Rol N,Corthesy B.Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut[J].Mucosal Immunol,2011,4(6):603-611.

[16] Li Huang,Qing-an Xu,Chang Liu,et al.Anti-caries DNA vaccine-induced secretory immunoglobulin a antibodies inhibit formation of Streptococcus mutans biofilms in vitro[J].Acta Pharmacologica Sinica,2013,34(2):239-246.

[17] Wenqing Ai,Yan Yue,Sidong Xiong,et al.Enhanced protection against pulmonary mycobacterial challenge by chitosan-formulated polyepitope gene vaccine is associated with increased pulmonary secretory IgA and gamma-interferon+ T cell responses[J].Microbiol Immunol,2013,57(3):224-235.

[18] 董竞男，刘建国，白国辉，等.M细胞-开启黏膜免疫的“门户”[J].国际免疫学杂志，2014,37(2):101-104.

[19] Golovkina TV,Shlomchik M,Hannum L,et al.Organogenic role of B lymphocytes in mucosal immunity[J].Science,1999,286(5546):1965-1968.

[20] Neutra MR ,Pringault E,Kraehenbuhl JP.Antigen sampling across epithelial barriers and induction of mucosal immune responses[J].Annu Rev Immunol,1996,14:275-300.

[21] Crotty S.Follicular helper CD4 T cells (TFH) [J] .Annu Rev Immunol,2011,29:621-663.

[22] 许安庆.防龋疫苗[J] .中国实用口腔科杂志,2012,5(10):591-594.

[23] Kim SH,Seo KW,Kim J,et al. The M cell-targeting ligand promotes antigen delivery and induces antigen-specific immune responses in mucosal vaccination[J].J Immunol,2010,185(10):5787-5795.

[24] 陈浪，袁军，凌天翼.黏膜免疫途径中明胶对抗SOD-IgA抗体应答的影响[J].贵州医药,2003,27(4):304-305.

[25] 蒋金凤，程安春，汪铭书，等.壳聚糖为递送载体的鸭肠炎病毒gC基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生的免疫反应[J].中国农业科学,2011,44(16):3454-3462.

[26] 艾文清,罗慕侠,曹颜霞,等.壳聚糖递送的结核基因疫苗诱导的肺部黏膜免疫及在抗结核免疫保护中的意义[J].现代免疫学,2011,31(2):93-100.

[27] Zissel G,Ernst M,Rabe K,et al.Human alveolar epithelial cells type Ⅱ are capable of regulating T cell activity[J].J Investig Med, 2000,48(1):66-75．

[28] Yuki Y,Kiyono H.Mucosal vaccines:novel advances in technology and delivery[J].Expert Rev Vaccines,2009,8(8):1083-1097.

贵州省科技创新人才团队资助项目[黔科合人才团队(2013)4026]、贵州省高等学校重点学科建设资助项目(SZXK-201207-04)、贵州省高等学校特色重点实验室建设项目[黔教合KY字(2013)109]和省市科技合作项目[省市科合(2014)41号]

R780.2

B

1000-744X(2016)04-0426-03

2015-10-17)