产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌研究进展

吴瑶瑶综述 张湘燕审校

(1.遵义医学院，贵州 遵义563003；2.贵州省人民医院呼吸内科，贵州 贵阳 550002 )

·综 述·

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌研究进展

吴瑶瑶1综述 张湘燕2审校

(1.遵义医学院，贵州 遵义563003；2.贵州省人民医院呼吸内科，贵州 贵阳 550002 )

肺炎克雷伯菌； 产超广谱β-内酰胺酶； 耐药性； 感染

感染性呼吸系统疾病不仅是临床上最常见的疾病之一，也是最常见的致死原因之一，导致了巨大的社会负担和经济负担，因此病原菌感染与抗感染治疗长期以来不仅是一个关系重大的社会问题，也是呼吸系统和其他相关临床及基础-临床领域密切关注的课题。产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌目前已在全世界范围内流行，且多重耐药菌株所占比例高，使临床治疗面临巨大挑战。因此，掌握产超广谱β-内酰胺酶菌株的流行病学特征、耐药的特点及相关检测方法，对有效地进行预防和控制至关重要。本篇文章就相关研究进展作一综述。

肺炎克雷伯菌是人体口咽部常见肠杆菌科寄殖菌之一，在高龄患者、劳累、酗酒或合并各种基础疾病时易诱发下呼吸道感染[1]。近年来，随着抗菌药物使用日益增多，尤其是三代头孢菌素类药物的不合理使用导致细菌对这些药物产生了耐药，特别是产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的细菌因其耐药谱广、所携带的耐药基因易于传播而备受关注。一项多中心研究中收集了北京、安徽、福建等6个地区下呼吸道感染耐药KP，多耐药菌株比例高达34.2%，耐药菌株呈现比例高、种类多、分布广、抗药性强的特点[2]。它的广泛流行使得临床抗感染治疗在抗生素选择方面越来越受限制，已成为目前有效治疗细菌感染的一个关键性问题[3-5]。这类细菌的耐药机制主要有以下3个途径：抗生素水解酶基因的获取、抗生素靶位点及膜蛋白基因突变、特点基因的差异性表达[6-7]。产生各种使抗生素失活的酶是KP临床分离菌株耐药的重要机制和环节[8]。

1 ESBLs的定义、来源和类型

1.1 定义与来源

超广谱β-内酰胺酶是指可水解包括单环β-内酰胺酶类抗生素和第三代头孢菌素在内的β-内酰胺类抗生素，并可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类β-内酰胺酶[9]。这类酶主要由质粒介导，广泛发现于大肠杆菌、阴沟肠杆菌及肺炎克雷伯菌等肠杆菌科中。

1.2 ESBLs的分类

根据Bush功能分类法[10]和Ambler的分子结构分类法[11]，ESBLs大部分属于Bush功能分类中的2be群，Ambler分类法中 A类，少数属于Bush 2d群、Ambler D类[10-11]。全球目前已经发现200多种ESBLs[12]。根据各个酶特性的不同，大致分为：SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他类型如：PER、VEB、GES、SPO等。

1.2.1 SHV型ESBLs SHV在肺炎克雷伯菌中20%由质粒介导的氨苄西林耐药是因为SHV-1[13]。SHV-1 β-内酰胺酶的变异位点为Gly238Ser和Glu240Lys，突变后分别对头孢他啶和头孢噻肟产生高效水解能力。其主要发现于阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌等细菌中。

1.2.2 CTX-M型ESBLs 该型酶对头孢噻肟的水解能力明显高于头孢他啶，故以Cefotaxime而命名为CTX-M。CTX-M型酶与TEM、SHV型酶同源性仅有39%[14]。最新研究[15-16]表明，该酶与Kluyvera ascorbate菌染色体上的AmpC酶具有更高的同源性。该酶对酶抑制剂敏感，但敏感程度有差别：他唑巴坦>克拉维酸>舒巴坦。对头孢他啶酶活性弱是多数CTX-M型ESBLs区别于TEM型、SHV型ESBLs的主要标志。CTX-M型ESBLs主要通过整合子、插入序列(ISEcpl)等方式在菌株间发生传播与扩散。

1.2.3 TEM型ESBLs TEM型ESBLs主要发现于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。在TEM-1和TEM-2的编码基因上的突变形成了该类型的酶，其主要的突变位点为Glu104Lys、Arg164Ser/His、Gly238Ser、Glu240Lys。TEM-2是TEM-1的第1个突变产物，两者等电点发生了变化，但酶底物谱未发生变化[17]。TEM-3与TEM-1相比：Glu104Lys、Gln39Lys、Gly238Ser，使得原有的特异性酶底物谱扩大，对β-内酰胺酶类抗生素及第三代头孢菌素产生广泛耐药[18]。

1.2.4 OXA型ESBLs OXA型ESBLs对OXA有很强的水解能力，故命名为OXA。该型酶属分子分类法中的D类和功能分类法中的2 d功能亚组，主要以对苯唑西林和氯唑西林的高水解性、对头孢菌素的水解能力不一、活性可被克拉维酸轻度抑制为特征。OXA型ESBLs主要为OXA-10，其水解头孢菌素的能力有所提高，较少被克拉维酸所抑制，其中第72位上丝氨酸被天冬酰胺所替代，第157位上的天冬氨酸代替甘氨酸，这两者的变化决定着ESBLs表型的呈现。OXA型酶主要存在于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及其他肠杆菌科细菌[5，19-20]。

1.2.5 其他类型ESBLs 其他的ESBLs有PER、VEB、MEN、TLA等。最新研究表明，在世界范围内不同地区陆续发现了除肠杆菌科外的其他菌种还存在有不同型别的ESBLs，如SFO、CME、GES、FEC等。这些酶均具有较强的水解头孢他啶和氨曲南的能力。

2 ESBLs分子流行病学分布特征

ESBLs的首次报道是在1983年德国，被发现于肺炎克雷伯菌和黏质沙雷菌中，近30年间，产ESBLs菌株已大范围出现在世界各地。但因各个国家、地区、医院使用的抗菌药物种类不同、细菌流行种类以及自然环境等不同，其检出率、基因型的分布在不同国家、不同地区和不同医院间也有很大差别。西班牙产ESBLs菌株具有高度多样性，但以CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14及TEM-4型最多见[21]；在美国则以TEM-10、TEM-26和TEM-12为主；英国以TEM-10和TEM-12为主；韩国以SHV-12、TEM-52和SHV-2a为主；OXA型主要分布于法国及土耳其；近年来CTX-M型在逐年增加，现已在全世界范围内呈流行趋势[22]。我国的ESBLs以CTX-M型及SHV型为主，常见的为CTX-M-14、CTX-M-9、CTX-M-3和SHV-12等。医院ESBLs检出率较高的科室为呼吸科、老干病房及ICU病房。主要原因：这些病房患者多合并有基础疾病、免疫力差，可能存在有免疫抑制剂的使用以及侵袭性操作等因素；在分子学方面，ESBLs基因位于质粒上，可通过接合转移、转座和转导等方式使耐药性发生传递。

3 ESBLs的检测方法

美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI)对肺炎克雷伯菌产ESBLs初筛和表型确证试验作如下推荐[23]。

3.1 表型初筛试验

标准纸片扩散法：选择头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢泊肟或头孢曲松(每片含量均为30 μg)，采用M-H琼脂平皿测试抑菌环直接，当头孢他啶≤22 mm或氨曲南≤27 mm或头孢噻肟≤28 mm或头孢泊肟≤17 mm或头孢曲松≤25 mm时，提示菌株可能产ESBLs。

该法简单易于操作，但特异性较差，因ESBLs对不同底物的水解能力不同，部分菌株在药敏试验中对单环类及头孢菌素类抗生素表现为敏感或中介，因此容易造成漏检。故该法仅能作为初筛试验，进一步证实还需进行表型确证试验。

3.2 表型确证试验

3.2.1 纸片表型确证试验 将待测菌制成浊度为0.5麦氏单位的菌悬液，用棉棒均匀涂布于M-H平皿上，把头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸药敏纸片贴在平皿上。35 ℃孵育18～24 h后观察结果。判定标按2009年版NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)标准：头孢噻肟/头孢噻肟加克拉维酸、头孢他啶/头孢他啶加克拉维酸，对照不加克拉维酸组抑菌圈直径≥5 mm为产酶株，即ESBLs阳性。该法简单、经济，常作为实验室常规检测。

3.2.2 E-test法 将头孢他啶以及复方制剂头孢他啶/克拉维酸分别置于试条两端，并将试条贴于受检菌株的M-H琼脂平板上，经35 ℃孵育18～24 h后，读取试条两端的MIC值≥8即可判定产ESBLs，否则为阴性。该方法更为敏感和特异，可读出具体MIC值，因此结论较为客观；缺点为试条价格昂贵，且试条上抗生素浓度梯度有限，有造成漏检的可能。

3.2.3 等电聚焦电泳 对未知的ESBLs进行等电聚焦电泳，将检测结果与已知酶的等电点(PI)进行比较，若相同则可能为同一种类，若不同可能为一种新的ESBLs。已知SHV型的PI一般在7.0～7.8；而TEM型的PI多在5.2～6.3；非SHV型非TEM型的PI高低不等。因此有些酶的等电点在相同或相近时难以用该法进行区别。

4 小 结

近30年间，产ESBLs的肺炎克雷伯菌在全世界范围内广泛流行，并且不断有新的产ESBLs菌株出现，各种ESBLs的特性有所差别。产ESBLs菌株可通过产酶基因的水平传播(如整合、转化、转导等)和产酶株的克隆传播造成耐药性的扩散及院内感染的流行。快速、准确的检测产ESBLs菌株对临床治疗、院内感染的控制有着重要意义，目前检测手段有多种，可根据各自优缺点灵活选择。全面客观的评价产ESBLs的肺炎克伯菌菌株的耐药性特点，对临床上抗生素的合理使用有着重要意义，可减少新的产酶菌株的产生。

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