黑素瘤发病机制相关蛋白的研究进展

张倩 周晓伟 王焱 孙建方

黑素瘤发病机制相关蛋白的研究进展

张倩 周晓伟 王焱 孙建方

黑素瘤是高死亡率的皮肤肿瘤，鉴定出与黑素瘤发病及进展相关的蛋白质有助于阐明黑素瘤的发病机制，临床上应早期诊断以提高疗效。近年来，比较蛋白组学、蛋白质表达谱等多种蛋白质组学研究方法应用于黑素瘤发病机制的研究，有助于明确相关细胞信号通路蛋白的功能，阐明肿瘤耐药机制、发现可能的肿瘤标记物以利于早期诊断、判断疗效和预后。

黑色素瘤；蛋白质组学；基因表达谱；肿瘤标记，生物学；信号传导

黑素瘤多原发于皮肤，高度恶性，死亡率高。若能早期发现、及时治疗可以治愈，一旦发生转移其生存率明显下降。为阐明其发病机制，精确进行分期、制订个体化治疗方案及评估预后，人们最初从基因水平上试图寻找分子靶标。然而，一个基因经过转录调节、RNA加工、蛋白质合成和修饰能产生许多不同的mRNA和蛋白质，即转录组和蛋白质组。蛋白质是细胞的实际功能分子，几乎负责细胞所有的生物化学活性，是生物功能的基础。蛋白质组学应用大规模蛋白质分离和鉴定技术，从整体蛋白质水平探索生命的本质及其规律，旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，介绍包括运用蛋白质组学技术在内的多种方法探索黑素瘤发病机制相关蛋白的新进展，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用等，从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。

1 比较蛋白组学在黑素瘤发病机制中的研究

Strömberg 等［1］采用以抗体为基础的蛋白质组学方法筛查正常组织、癌组织和细胞系中组织微阵列的蛋白表达，鉴定出一个新的突触融合蛋白，具有黑素细胞选择性的蛋白表达模式，进一步通过2个独立的黑素瘤队列研究表明，突触融合蛋白在黑素瘤中表达水平与肿瘤分期呈负相关，突触融合蛋白的表达水平越低，肿瘤侵袭性越强，作者认为，以抗体为基础的蛋白质组学方法是发现黑素瘤生物标志物的一个很有吸引力的策略。Greco等［2］用基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析方法和二维电泳相结合的蛋白质组谱方法，分析了50例拟手术治疗的可疑黑素瘤患者的血清样品，发现转甲状腺素蛋白和血管紧张素原表达升高，维生素D结合蛋白表达下降。通过检测使维生素D结合蛋白糖基化的α-N-乙酰半乳糖胺酶活性，可以无创性地检测黑素瘤的严重程度。Nawarak等［3］用二维电泳结合MALDI-TOF MS和MS/MS方法分析了熊果苷对A375黑素瘤细胞系蛋白质表达谱的影响，从蛋白组学探索熊果苷的抗癌效应。发现26个差异表达的蛋白质中7个蛋白显著上调，19个蛋白显著下调；进一步经反转录PCR及蛋白质印迹方法分析验证得出 14-3-3G、VDAC-1、p53 上调；VIME、PRDX1、ENPL、IMDH2、ENOA 下调，并用生物信息学分析这些蛋白的功能以及预测蛋白之间相互作用，发现这些蛋白在肿瘤的抑制中起重要作用和描绘出调控细胞凋亡蛋白相互作用网络。

作者单位：210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室皮肤外科（张倩、周晓伟、王焱），病理科（孙建方）

2 蛋白质表达谱在黑素瘤发病机制中的研究

Baruthio 等［4］用液相色谱-串联质谱鸟枪法（shotgun）在检测黑素瘤细胞系的耐洗涤剂膜（detergent resistant membranes）中共鉴定出177种蛋白质，5′-核苷酸酶CD73经二维电泳被证实，放射状生长阶段细胞中的维生素D结合蛋白比转移细胞中的更丰富。同样，MYOF、CDH13、LGALS1在放射状生长阶段-放射状生长阶段/垂直生长阶段细胞的耐洗涤剂膜中比转移细胞更丰富。18种蛋白质富含于转移细胞系中；FERM、MFGE8、SPTA和SPTB、STOM以及RALB也在转移细胞的耐洗涤剂膜中表达增多。该研究证实，蛋白质MFGE8、ATP6V1B2、GAL3、FLOT2在垂直生长阶段和转移细胞系的耐洗涤剂膜中更丰富，而CDH13仅在放射状生长阶段细胞系的耐洗涤剂膜中观察到。黑素瘤细胞特殊的耐洗涤剂膜蛋白质结构与细胞恶性程度有关，提示一些蛋白质与耐洗涤剂膜成分的相互作用可能在黑素瘤的进展中得到调节，并在疾病进展中有一定作用。

Carta等［5］对同一黑素瘤患者原始和转移损害的细胞系和短期培养的黑素细胞进行蛋白质组学研究，通过二维电泳分析了短期培养的黑素瘤细胞溶解产物，鉴定出参与黑素瘤进展的8种候选基因：PRDX2、HSP27、HSP60、HSPA8、HSP9B、STIP1、PDI、P4HB，并通过实时反转录PCR分析检测mRNA表达水平，评价了原发和转移恶性黑素瘤蛋白质表达的差异：休克蛋白（HSP）27、60、A8 过度表达，而PRDX2低表达。

3 关键通路蛋白在黑素瘤发病机制中的研究

研究发现，BRAF是参与黑素瘤发病机制中最常变异的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是RAF蛋白家族的成员之一，在52%～82%黑素瘤和黑素细胞皮损中突变。BRAF参与RAS-RAF-丝裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）-细胞外信号调节激酶（ERK）通路，使160种以上蛋白质磷酸化。活化的BRAF突变主要发生在黑素瘤的进展期，很少发生在晚期，表明该通路较早的活化在黑素瘤的起始和进展中起作用［6］。

有作者用蛋白质组学方法进一步区分MeWo和 MM418两个黑素瘤细胞系，以研究干扰素（IFN）活性的分子基础和抵抗的可能机制。MM418和MeWo细胞系对IFN的抗增殖作用分别表现为敏感和抵抗，因此，用来研究黑素瘤细胞对IFN的不同反应。IFN-α抑制MM418生长，对MeWo无抑制作用。两个细胞系经IFN-α诱导后均见人类白细胞抗原ABC、STAT1α、p91蛋白表达。CTSB在MM418中表达水平显著高于MeWo。PA28α在两个细胞系中均明显上调，但在MM418中表达水平更高［7］。蛋白印迹试验证实，α/β-SNAP在经IFN-α治疗的两个细胞系中均上调。

4 黑素瘤肿瘤标记物的研究

Sinha 等［8］运用二维电泳与 MALDI-TOF MS 相结合的蛋白质组学方法分析了对抗癌药物（去乙酰长春酰胺、依托泊甙、顺氯氨铂、福替目丁）耐药的黑素瘤细胞的蛋白质谱表达特点，发现电压依赖性阴离子通道蛋白过表达。另有一些耐药的黑素瘤细胞的分子伴侣过表达，包括HSP。几乎每个耐药的细胞中HSP27过表达，大多数细胞系中，HSX70或HSP60异构体上调。HSP90在顺氯氨铂、福替目丁抵抗的细胞中下调。谷胱甘肽还原酶在一些耐药的人黑素瘤细胞系MeWo中差异性高表达，在谷胱甘肽减少的细胞质中维持高水平，故可作为谷胱甘肽浓度的间接标记。蛋白质组学分析有助于阐明耐药的机制，进而指导人体靶向治疗［9-10］。

血管内皮生长因子（VEGF）C和VEGF-D高表达与黑素瘤转移至前哨淋巴结的频率增加相关。SPP1和PRAME被鉴定为黑素瘤特异标记物，可在前哨淋巴结鉴别黑素瘤细胞与痣细胞。Melan-A和酪氨酸酶表达水平可用于评估患者生存状况。在黑素瘤阳性的前哨淋巴结中，白细胞介素（IL）13、瘦素、淋巴毒素β受体、巨噬细胞炎症蛋白明显升高，而IL-11 Ra下降。这些基因水平的测定有助于评估前哨淋巴结。另外，前哨淋巴结CD4T细胞OX40（CD134）的表达也有助于前哨淋巴结的评估，该基因在黑素瘤的进展期表达下降。观察循环中黑素瘤细胞的标记包括：酪氨酸酶、Melan-A、MAGE-3、黑素瘤细胞黏附分子18、p97、gp100。使用MAGEA-plex、MART-1、酪氨酸酶描述循环中黑素瘤细胞最有效，因为它们在外周血中黑素瘤细胞中的表达至少达1 000倍以上，循环系统中发现黑素瘤细胞高度提示预后不良。酪氨酸酶RNA水平测定已经成为重要的无病生存的反向预后因素［11］。TA90IC、MIA蛋白可预测三期患者的生存。MAGE-3与疾病进展相关性最佳。VEGF受体1、转化生长因子（TGF）β1、BCL-2、SKP2 和 p27（KIP1）与黑素瘤进展有关。

5 与黑素瘤转移相关蛋白的研究

去磷酸丝切蛋白通过切割浆膜附近存在的肌丝使肌动蛋白聚合产生新的刺端来促进黑素瘤细胞的侵袭。丝切蛋白切割肌动蛋白的能力可通过Rho家族小GTP激酶的下游信号而被终止，一旦肌动蛋白被聚合，则不能立即被切割。在其他环境，PIP2水平增加可通过结合和替换肌动蛋白肌丝加帽蛋白（如肌动蛋白肌丝末端的凝溶胶蛋白），从而促进肌动蛋白聚合。高水平的凝溶胶蛋白可减少黑素瘤细胞的转移。所有肌动蛋白聚合的机制均依赖于细胞内肌动蛋白单体的可用性，其常被纤维蛋白、胸腺素β4等分子抑制。这些分子在转移性黑素瘤中上调［12］。

细胞外基质的主要调节介质是整联蛋白［7］，在侵袭性黑素瘤中整联蛋白表达下调，其可形成由α和β亚基组成的二聚体复合体。αVβ3二聚物可结合一系列含有氨基酸序列RGD的配体（包括纤维蛋白），对黑素瘤的潜在侵袭性尤其重要。整联蛋白结合的主要细胞外基质成分为胶原、层粘连蛋白和纤维蛋白；阻断整联蛋白与层粘连蛋白和纤维蛋白相互作用的多肽已被证实，可减少黑素瘤体外运动性和在体内的转移。基质成分的产生在侵袭性黑素瘤中也发生改变，如纤维蛋白、SPARC、TNC和某些层粘连蛋白的表达在侵袭性和转移性黑素瘤中增加，研究表明，这些基质成分能促进黑素瘤细胞的运动性。促使细胞体运动的动力来自肌动蛋白和肌球运动蛋白的相互作用，主要受非肌细胞类型的磷酸化作用调节。许多影响调节性肌球蛋白亚单位的磷酸化途径在转移性黑素瘤细胞中上调。RhoC可通过结合ROCK1和ROCK2提高肌动蛋白-肌球蛋白收缩性，ROCK1、ROCK2（也称 Rho或 ROKα） 调节MLC激酶磷酸化作用，RhoC的高表达是黑素瘤模型转移的关键。抑制RhoC之后，RhoA或ROCK1&2可减少黑素瘤细胞的侵袭性，可能是治疗干预的潜在途径。ROCK激酶抑制剂可在鼠模型中减少黑素瘤转移［13］。多功能蛋白 MTS1（S100A4）在黑素瘤中下调，可促进肌动蛋白-肌球蛋白相互作用。为了肌动蛋白-肌球蛋白收缩有效移动细胞体，F肌动蛋白网络需要与细胞基质粘连体和浆膜相连接，需要一系列相关蛋白的支持，如PIP2或完整的膜蛋白与F肌动蛋白和薄膜成分结合，这些蛋白和细胞骨架连接蛋白在黑素瘤转移时表达增加［12］。

体外实验中，大多数黑素瘤细胞在细胞周围多点粘连。如果这些粘连体收缩，且没有粘连的重塑，细胞将产生内张力而运动，因此，有效地运动需要一些粘连复合体的分离。微小管网络作用于粘连点使其分离，有利于动力蛋白介导的动摇粘连的蛋白质传递。激酶FAK和ERK可促进粘连复合物的翻转。FAK在黑素瘤中过表达，而ERK1在转移性黑素瘤的一个模型中过表达。粘连成分可被细胞内蛋白酶分解，如受ERK调节的钙蛋白酶。抑制钙蛋白酶可减少与高水平整合蛋白αVβ3相关黑素瘤的迁移。大量的研究表明，基质金属蛋白酶（MMP）在侵袭性黑素瘤中上调，对促进黑素瘤的播散起重要作用。然而不同的MMP有侵袭和抗侵袭性能，因此，目前广泛的MMP靶向抑制剂在临床中尚未取得成功。另一可能失败的原因是非MMP蛋白酶的潜在作用，如细胞外基质蛋白水解中的组织蛋白酶［14］。组织蛋白酶在黑素瘤中常下调，药物抑制可减少黑素瘤细胞的侵袭。uPA serine蛋白酶和其受体在黑素瘤进展中，可通过他们的能力活化细胞内信号通路，如小GTPase-Rac1通路。HGP、TGF-β可上调许多参与黑素瘤运动的基因，包括纤连蛋白、各种胶原蛋白、整联αV、CD44、VEFG-A，并下调E钙黏着蛋白。TGF-β通过转录因子的snail家族上调其作用，这可驱动基因表达的间叶细胞模式，以促进细胞运动和侵袭。snail家族蛋白［15］在侵袭性黑素瘤中高表达，活性增加，能减少E钙黏着蛋白、occludin和claudin表达，而提高N钙黏着蛋白水平有助于黑素瘤细胞与基质细胞而非角质形成细胞的相互作用。snail还可调节细胞运动基因的表达，包括MMP-2、SPARC、金属蛋白酶组织抑制因子 1、RhoA［12］。

6 结语

蛋白质组学作为先进方法鉴定未知蛋白质、研究蛋白质功能、高通量监控蛋白质差异表达等，借助技术的突飞猛进和成本的降低，在黑素瘤研究中的应用日益广泛。高通量筛选数目众多的蛋白质会出现很多假阳性结果，需要研究者深入了解研究背景，借助生物信息学挑选出有意义的蛋白质，再鉴定、验证其功能和相关作用。借助蛋白质组学等方法研究黑素瘤发病机制相关的蛋白，有利于发现肿瘤标记物和肿瘤转移相关的蛋白，对黑素瘤早期的诊断、判断预后意义重大。

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Proteins associated with the pathogenesis of melanoma

Zhang Qian,Zhou Xiaowei,Wang Yan,Sun Jianfan.Department of Dermatologic Surgery,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Melanoma is a kind of skin cancer with high mortality.Identifying proteins associated with the initiation and progression of melanoma is beneficial to elucidating the pathogenesis of melanoma.Early diagnosis is important for effective treatment of melanoma.Recently,proteomics,including comparative proteomics and protein expression profiling,has been applied to researches into melanoma,which will help to clarify the functions of related cell signaling pathways,elucidate mechanisms underlying drug resistance in tumors,discover tumor markers,so as to facilitate early diagnosis as well as predilection of therapeutic efficacy and prognosis.

Melanoma;Proteomics;Gene expression profiling;Tumor markers,biological;Signal transduction

s:Wang Yan,Email:drwangyan@163.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

2015-01-20）

国家自然科学基金（81272992）；江苏省自然科学基金（BK20131063）；江苏省临床医学科技专项（BL2012003）；江苏省科技基础设施建设计划（2012ZD011）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China （BK20131063）;Jiangsu Provincial Special Program of Medical Science （BL2012003）；Science and Technology Infrastructure Development Program of Jiangsu Province（2012ZD011）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.01.014

王焱，Email:drwangyan@163.com，孙建方，Email:fangmin5758@aliyun.com

本文主要缩写：MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱，HSP：休克蛋白，MEK：丝裂原激活蛋白激酶的激酶，ERK：细胞外信号调节激酶，IFN：干扰素，VEGF：血管内皮生长因子，IL：白细胞介素，TGF：转化生长因子，MMP：基质金属蛋白酶，