聚合酶链反应检测梅毒螺旋体的进展

叶兴东 林宏达 戴向农 任泽舫

聚合酶链反应检测梅毒螺旋体的进展

叶兴东 林宏达 戴向农 任泽舫

梅毒是由苍白螺旋体感染引起的一种常见系统性性传播疾病，早诊早治梅毒有利于减少传播、减轻系统损害。直接暗视野检查苍白螺旋体或血清抗体检测是诊断梅毒的主要手段，但有局限性。聚合酶链反应通过扩增苍白螺旋体靶序列诊断梅毒，而polA、tpp47基因为聚合酶链反应法检测苍白螺旋体常用靶基因。反转录聚合酶链反应和巢式聚合酶链反应的敏感性高于其他聚合酶链反应法。聚合酶链反应法检测一期梅毒拭子中苍白螺旋体敏感性可达60%以上，而检测血液及脑脊液苍白螺旋体敏感性不超过60%（胎传梅毒可达83%），特异性93%以上。患者HIV感染与聚合酶链反应检测敏感性无关。

梅毒；苍白密螺旋体；聚合酶链反应；诊断；基因

梅毒是由梅毒苍白螺旋体（Tp）感染引起的性传播疾病，有胎传梅毒和获得性梅毒，后者又分为早期梅毒（包括一期梅毒、二期梅毒、早期隐性梅毒）和晚期梅毒（包括三期良性梅毒、心血管梅毒、晚期隐性梅毒）、神经梅毒［1］。Tp不能体外培养，兔睾丸培养Tp耗时且难于普及［2］，硬下疳拭子暗视野显微镜检测Tp敏感性仅72%［3］，无临床症状时，血清特异性及非特异性梅毒抗体检测阳性也仅为推测性诊断梅毒，因此，诊断早期梅毒、潜伏梅毒需更敏感及特异的方法。PCR直接扩增Tp靶基因序列，诊断梅毒具有敏感、特异等特点，且可检测多种临床标本。

1 PCR技术检测Tp的不同方法

自PCR技术发明以来，经典PCR、反转录PCR（RT-PCR）、巢式PCR、定量PCR和实时定量PCR等相继用于梅毒的诊断。

1.1 经典PCR法：Hay等［4］首次用PCR法检测有中枢神经损害的梅毒合并HIV感染者脑脊液中的Tp，结果50%（7/14）阳性，认为该方法检测效能为130 Tp分子/ml，检测Tp DNA的敏感性47%，特异性93%，但检测无梅毒治疗史的患者脑脊液时，敏感性为59%，特异性97%，阳性预测值91%，阴性预测值是83%。该方法需要技术熟练，且产物容易被污染。

作者单位：510095广州市皮肤病防治所（叶兴东、戴向农）；中山大学公共卫生学院医学统计与流行病学系（林宏达、任泽舫）

1.2 RT-PCR 法：Marra 等［5］用 RT-PCR 方法，优化引物设计后，检测326例患者脑脊液中Tp DNA，阳性率为 8%（26/326），Tp DNA阳性者脑脊液中，白细胞计数显著高于Tp DNA阴性者，分别为34.5 个/μl、2 个/μl，RT-PCR 检测脑脊液中的 Tp DNA的效能可达1～10个Tp分子/ml。

1.3 巢式 PCR 法 Grange等［3］以 Nichol 株（4 ×107个/ml）连续1∶10稀释成标准DNA为参照，用巢式PCR和暗视野显微镜法同时检测109份标本中的 Tp，阳性率分别为 82.6%（90/109）、73.4%（80/109），暗视野显微镜的敏感性和特异性分别为73%、88%，而巢式PCR法检测Tp的敏感性和特异性则分别为82%、95%，与梅毒临床诊断相比，巢式PCR法阳性预测者为94%，阴性预测值为57%，检测TP效能约为20个Tp分子/ml，高于经典PCR方法的检测脑脊液中Tp的效能。

1.4 定量PCR：又称实时定量PCR，Gayet-Ageron等［6］用定量PCR检测74例患者的126份不同生物样本中的Tp DNA，结果不分样品类别，定量PCR检测TP DNA整体敏感性分别为65%、53%；检测效能为0.05pg DNA（相当于10个Tp分子基因组DNA的量），大致相当于10×103个/ml，而定量PCR在潜伏梅毒患者血液中未检出Tp。Chi等［7］报道定量PCR检测皮损中Tp-DNA敏感性仅 15.5%，Gayet-Ageron 等［2］Meta分析表明，经典 PCR、RT-PCR 和巢式PCR的敏感性较定量PCR和多重PCR高出100倍，各种PCR法检测Tp的特异性达93%以上，但某些梅毒标本（如脑脊液）的特异性可低至83%。不同PCR方法各有优缺点，如经典PCR容易污染，干扰因素多，RT-PCR中RNA保存要求高，提取时容易降解，使反转录中c-DNA量不稳定，实时定量PCR虽然敏感性稍低，但无需电泳，且因密闭环境，污染源少。而巢式PCR，经历初始几个循环后，模板得到放大，提高了目的基因的检测能力，综合起来，巢式PCR是检测Tp较为理想的PCR技术。

2 PCR检测TP的靶基因

PCR技术可通过检测多种靶基因，诊断Tp感染 ， 如 膜 蛋 白 基 因 4D、tmpA、tmpB、tmpC、bmp、tpp47、TP0136、TP0548［8-9］，核糖核蛋白基因 16S rRNA、23SrRNA［9-10］以及polA基因等［9，11］，tpp47 和polA是最常用的靶基因［2-3，6，9，12-17］，检测 Tp 的效能基本类似［12］。

2.1tpp47基因：tpp47编码相对分子质量为47 000的青霉素结合蛋白，与其他细菌和真核生物DNA无同源性［6］，该蛋白能裂解β内酰胺类抗生素，其功能受β内酰胺酶活性产物的抑制，这对保留Tp对青霉素敏感至关重要［18］。以tpp47为靶基因，视不同类型标本，PCR检测Tp-DNA的敏感性14%～95%［3，6，14，19］。Grange 等［3］报道，检测血液中 Tp-DNA敏感性为 14.7% ～ 29%。Gayet-Ageron 等［6］对 74 例患者126份样品进行Tp DNA检测，结果隐性梅毒血液中Tp全部阴性，视一期梅毒不同血液成分，Tp敏感性28%～55%，而二期梅毒则为36%～47%。Dai等［14］对372例疑似梅毒患者溃疡拭子进行Tp DNA检测，316例（86%）Tp DNA阳性。Gayet-Ageron等［12］同时用tpp47-PCR和polA-PCR方法，分别检测了272份性病性溃疡拭子，结果表明，两个靶基因检测Tp DNA的敏感性类似，tpp47基因检测拭子标本中Tp DNA敏感性62.5%～95%，检测脑脊液中Tp敏感性接近60%。

2.2polA基因：polA是一高度保守基因，编码Tp DNA聚合酶Ⅰ，有两个特点：一是其编码氨基酸序列中，半胱氨酸残基高达24个之多，而在其他大多数生物中该基因仅有1～2个半胱氨酸残基。二是在Tp基因组中，有4个特异性碱基序列，这两个特征使得Tp-polA基因具有高敏感性和特异性，因此，扩增polA的引物选择在有额外插入和半胱氨酸残基的DNA序列区域。Liu等［17］首次用该基因检测Tp，发现polA基因检测Tp的能力为2拷贝/50 μl反应体系，与多重PCR法比较，PCR检测Tp的能力可以提高10个数量级，敏感性和特异性分别达到95.8%、95.7%。Peng 等［20］PCR 法检测 110 份疑似梅毒患者样本中的Tp，提示该基因敏感性和特异性分别为 83.3%、92.9%。Flasarová等［9］以巢式 PCR 等检测294例疑似梅毒患者的415份临床标本中Tp DNA，视梅毒类型与标本类型而异，阳性率位于22.2% ～ 64.7%；具体而言，一期、二期、隐性梅毒阳性率分别为 64.8%、22%、8.8%，而同样方法，tpp47基因检测隐性梅毒血液Tp阴性［6］。Gayet-Ageron等［2］用Meta分析发现，polA比tpp47基因具有更高的阳性似然比。可见，polA基因是PCR检测Tp时最佳引物候选基因之一。

3 PCR检测Tp的临床标本

3.1 皮损拭子：PCR方法检测不同病期梅毒皮损拭子，Tp 敏感性 60% ～ 95%［2-3，11，16］。Gayet-Ageron 等［2］发现，梅毒流行区梅毒血清学阴性的生殖器溃疡拭子Tp敏感性为78.4%，皮损阳性似然比是血液阳性似然比的2倍。Grange等［3］对230例梅毒患者中149例（77例HIV阴性，72例HIV阳性）拭子进行Tp DNA检测，发现HIV阴性患者拭子的阳性率为83.3%，敏感性和特异性分别为83%、96%，而HIV阳性者拭子阳性率为75%，敏感性和特异性分别为76.4%、93.3%。一期、二期梅毒拭子阳性率分别为81.3%、76.8%。诊断梅毒与暗视野显微镜结果高度一致（κ =0.53），阳性似然比为 18，阴性似然比为0.18。Martin 等［16］对 41 例梅毒（其中一期 19 例）患者53份临床标本检测Tp-DNA，结果一期梅毒拭子阳性率为60%，如剔除样本中DNA含量不足因素，实际阳性率可以提高到75%，作者认为，溃疡拭子是检测一期梅毒的最佳标本选择。李军和郑和义［21］综合国内外文献，认为PCR用于检测梅毒螺旋体DNA时，对一期梅毒患者溃疡性皮损的敏感性较高，对二期梅毒患者血液标本的敏感性不高。Gayet-Ageron等［6］检测74例早期梅毒患者126份不同生物样本中的Tp，结果一期梅毒患者拭子敏感性为80%，高于二期梅毒拭子敏感性（20%）。Wu 等［13］检测136例患者211份标本（拭子75份）中Tp-DNA，结果拭子阳性率为63%，高于血浆（49%）和血清（36%）的敏感性。Gayet-Ageron 等［2］用 Meta分析发现，PCR法检测溃疡拭子Tp敏感性可达75.9%，特异性96.5%。总体上，PCR法检测梅毒皮损拭子Tp阳性率在60%以上，一期梅毒最高可达95%，高于二期梅毒皮损阳性率。

3.2 梅毒患者血液或血液成分：Sutton 等［11］首次报道，在梅毒患者血液中检出Tp，但阳性率仅27%，低于拭子阳性率。Grange等［3］对294例疑似梅毒血液标本进行Tp-DNA检测，结果外周血单核细胞、血浆、血清、全血碎片的检测Tp DNA敏感性分别为29%、18%、14.7%、24%。Wu 等［13］报道 125 份梅毒患者血液Tp-DNA检测结果，血浆、血清 Tp-DNA阳性率分别为49%、36%；二期梅毒患者血液Tp-DNA阳性率为58.6%，高于一期梅毒及隐性梅毒患者的阳性率（7.7%）。Castro 等［22］首次在耳垂血中检出Tp，作者对69例潜伏梅毒和18例治疗后的梅毒患者全血、血浆、血清和耳垂血进行Tp-DNA检测，共235份潜伏梅毒血样，视不同PCR引物，PCR检测全血Tp阳性率位于25%～56%，多重PCR阳性率38.3%，耳垂血阳性率最高 56%，血清最低（25%），提示耳垂血是潜伏梅毒患者检测Tp的优先样本。Peng等［23］的研究也支持该观点，认为耳垂血提取Tp-DNA的量平均高于血浆、全血和脑脊液而有利于潜伏梅毒Tp的分型。血液采样时要注意患者是否经过驱梅治疗，因为驱梅抗生素会导致血中Tp载量下降，甚至呈假阴性。Wang等［24］研究显示，梅毒患者治疗后外周血Tp-DNA下降，并且认为，外周血检测Tp-DNA不敏感。与拭子检测Tp类似，HIV感染状态均不影响血液 Tp-DNA 检测结果［3，13］。Gayet-Ageron等［2］用Meta分析发现，PCR检测血液中Tp-DNA，除了胎传梅毒敏感性高达83%之外，其余各类型梅毒血液敏感性均低，血液成分中，血浆和血清高于全血（但差异无统计学意义），与此相反，溃疡或皮损检测Tp敏感性高于70%。

3.3 其他临床样本：除了常用的溃疡拭子、血清（浆）外，其他如脑脊液［6］、尿液［6］、眼内液［13，15，25］、石蜡包埋的组织［26］、淋巴结［27］、关节液、羊水［28］等均能发现Tp，并用于梅毒的诊断。Wu等［13］检测9例脑脊液和2份玻璃体液，结果Tp DNA阳性率18%。Dumaresq等［29］检测120例合并早期梅毒的HIV感染者脑脊液中TP-DNA，敏感性为58%，特异性为67%、阴性预测值为85%。Gayet-Ageron等［6］首次检测尿液中Tp-DNA，结果一期、二期梅毒患者尿液中Tp-DNA敏感性分别为29%、44%。作者认为，尽管尿液检测Tp敏感性低，但为最容易获取的标本，有一定的检测价值。

4 结语

PCR技术检测Tp-DNA敏感性视不同梅毒类型、不同样本、靶基因的选择、患者治疗情况等有关。经典PCR、RT-PCR、巢式PCR的敏感性较定量PCR和多重PCR好；梅毒患者皮损拭子Tp阳性率高达60%以上，除了胎传梅毒外，血液Tp阳性率不超过60%，且二期梅毒血液阳性率高于一期梅毒，耳垂血检测Tp是潜伏梅毒较有价值取材途径，脑脊液中Tp检测为临床诊断神经梅毒提供重要的补充手段，至于PCR引物候选基因，tpp47、polA两个基因检测Tp效能基本相似，但polA基因阳性似然比高于tpp47基因。驱梅治疗后Tp阳性率可以下降，但HIV感染状态不影响血液或溃疡拭子中Tp的检测。巢式PCR和定量PCR结合是否可以提高PCR检测TP DNA的敏感性值得关注。

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Application of polymerase chain reaction in detection ofTreponema Pallidium:an update

Ye Xingdong*,Lin Hongda,Dai Xiangnong,Ren Zefang.*Department of Dermatology,Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China

Syphilis is a chronic and systemic sexually transmitted disease caused byTreponema pallidium（TP）.Early diagnosis and treatment are helpful in reducing spread of syphilis and in attenuating systemic damage.Direct detection of TP by dark-field microscopy （DFM）and serological tests for antibodies have been the main diagnostic means for syphilis,but they both have limitations.Polymerase chain reaction（PCR） techniques are currently applied in the diagnosis of syphilis by amplifying target sequences of TP,andpolAandtpp47genes are the commonest target sequences for the detection of TP with PCR.Reverse transcription PCR and nested PCR show higher sensitivity than other PCR techniques.The sensitivity of PCR techniques is above 60%for detection of TP DNA in swab samples from primary syphilis lesions,less than 60%in blood and cerebrospinal fluid samples （up to 83%in samples from patients with congenital syphilis）.However,the specificity of PCR techniques is usually above 93%for the detection of TP.HIV status does not influence the sensitivity of PCR techniques.

Syphilis;Treponema pallidum;Polymerase chain reaction;Diagnosis;Genes

Ye Xingdong,Email:xingdongye@21cn.com

2015-02-25）

广东省科技计划项目（2012B031800014）；广州市科技攻关项目（201300000166）；广州市医药卫生科技项目（20121A031001）

Fund programs:Science and Technology Planning ProjectofGuangdong Province ofChina（2012B031800014）;Guangzhou Program forScienceand TechnologyDevelopment （201300000166）;Guangzhou Science and Technology Program for Medicine and Health （20121A031001）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.01.006

叶兴东，Email:xingdongye@21cn.com