DADS上调miR-200b抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭

刘越峰，张勇，钟晓东，罗卫民

(湖北医药学院附属十堰市太和医院眼科中心1、心胸外科2，湖北 十堰 442000)

DADS上调miR-200b抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭

刘越峰1，张勇1，钟晓东1，罗卫民2

(湖北医药学院附属十堰市太和医院眼科中心1、心胸外科2，湖北 十堰 442000)

目的 探索miR-200b和二烯丙基二硫(DADS)相关的抑瘤机制，为揭示DADS抑制视网膜母细胞瘤生长及侵袭的内在分子机制提供理论依据。方法采用qRT-PCR分别检测不同浓度的DADS对Y79细胞miR-200b表达的影响，DADS分别设置六种浓度：0µmol/L、25µmol/L、50µmol/L、100µmol/L、200µmol/L和400µmol/L。MTT和Transwell侵袭实验分别检测DADS和miR-200b对Y79细胞生长及侵袭能力的影响，将实验设置成五个组，即miRNA阴性对照组(瞬时转染scramble 40 μmol/L)；miR-200b组(瞬时转染miR-200b-mimics 40 μmol/L)；DADS阴性对照组(DMSO 10 μmol/L，即mock组)；DADS组(DADS 200 μmol/L)和DADS+miR-200b组(瞬时共转染miR-200b-mimics 40 μmol/L)和DADS(200 μmol/L)。结果DADS可上调Y79细胞中miR-200b的表达，且其呈剂量依赖性(P＜0.05)；在MTT实验中，miR-200b组的OD值(0.549±0.057)较miRNA阴性对照组(0.737±0.135)明显降低；DADS组的OD值(0.508±0.064)较DADS阴性对照组(0.722±0.145)明显降低；而DADS+miR-200b组的OD值(0.362±0.081)较miRNA阴性对照组和DADS阴性对照组降低最为显著(P＜0.05)，即DADS可以通过上调miR-200b抑制Y79细胞的增殖能力。在Transwell侵袭实验中，外源性的高表达miR-200b组(105±13)较miRNA阴性对照组(162±12)能够显著抑制Y79细胞的穿膜细胞数，DADS组(102±13)较DADS阴性对照组(154±8)能够显著降低Y79的穿膜细胞数，且DADS+miR-200b组(77±8)，细胞穿膜细胞数较miRNA阴性对照组和DADS阴性对照组减少最显著(P＜0.05)，即DADS通过上调miR-200b抑制Y79细胞侵袭。结论DADS通过上调miR-200b的表达抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长及侵袭。

视网膜母细胞瘤；MiR-200b；二烯丙基二硫；增殖；侵袭

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)对肿瘤的抑制作用多有报道，其为一种最初从大蒜中提取得到的天然化合物二烯丙基二硫。研究报道显示DADS可抑制肺癌、胃癌、乳腺癌和白血病等多种恶性肿瘤[1-2]。在胃癌中，DADS可抑制细胞的生长并诱导分化[3-4]。在结肠癌中，DADS可抑制肿瘤细胞的增殖[5]。在白血病中，DADS可阻滞细胞的细胞周期[6]。而DADS的抑癌机制与其能抑制DNA的加合物及活性氧形成、激活解毒致癌物的代谢酶、阻滞细胞周期和诱导肿瘤细胞凋亡等相关[7]。

MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性的单链非编码RNA分子，通过与其靶基因3′-UTR(3′-非编码区)的完全或不完全配对，miRNA能使翻译抑制或者使靶mRNA降解，并转录后水平上对靶基因的表达进行调控[8]。在肿瘤的发生及发展过程中，miRNA可对细胞的增殖、分裂、分化及调亡等重要的生物学过程进行调控，发挥抑制或促进肿瘤进程的作用。据报道，miR-200b在多种细胞，组织或实体肿瘤中表达下调，并与多种肿瘤的生长增殖或复发转移等相关，如乳腺癌[9]、胃癌[10]和胶质瘤[11]等。

视网膜母细胞瘤是原发于视网膜的恶性肿瘤，常见于儿童的眼部肿瘤。患者按类型可分为非遗传型和遗传型两种，非遗传型常见于单侧发病，无遗传性；遗传型常见于双眼发病，有阳性家族史，发病迅速，易转移恶化导致死亡[12]。目前对miR-200b在视网膜母细胞瘤组织和细胞中的表达情况报道较少，DADS在视网膜母细胞瘤中的抑制作用和内在机制的研究亦不深入。本研究从miR-200b的角度揭示DADS抑制视网膜母细胞瘤生长及转移的分子机制，为视网膜母细胞瘤的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人视网膜母细胞瘤Y79细胞；Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司；MTT试剂盒购于美国Sigma公司；Transwell小室购于美国BD公司；miR-200b mimics、miR-200b inhibitor和scramble购于丹麦Exiqon公司；RNA抽提试剂盒购于美国Applied Biosystems公司；TIMP3和β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 qRT-PCR 适量人视网膜母细胞瘤标本和癌旁正常组织，抽提组织中总RNA，逆转录合成cDNA，并保存于-80°C中备用。采用六种浓度的DADS(0µmol/L、25µmol/L、50µmol/L、100µmol/L、200µmol/L和400µmol/L)分别处理Y79细胞，48 h后收集每组细胞，提取总RNA。miR-200b(正向)5′-CGCAGCTACATCTGGCTACTG-3′，miR-200b(反向) 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6(正向)5′-GCGCG TCGTGAAGCGTTC-3′，U6(反向)5′-GTGCAGGGTC CGAGGT-3′。PCR体外扩增反应体系为20 μl，包括Taq DNA polymerase 0.2 μl(5 U/μl)，PCR primers 0.4 μl (5 μmol/L)，2×SYBR Mix 10 μl，RT product 2.0 μl及灭菌蒸馏水7.4 μl。循环体系为：96°C 3min，96°C 15 s，65°C、35 s，73°C、30 s，共计38个循环，以U6为内参，测得的miR-200b相对表达量用2-ΔΔCT法来进行分析。

1.3 MTT法 实验共分五组：(1)miRNA阴性对照组(瞬时转染scramble 40 μmol/L)；(2)miR-200b组（瞬时转染miR-200b-mimics 40 μmol/L)；(3)DADS阴性对照组(DMSO 10 μmol/L)(即mock组)；(4)DADS组(DADS 200 μmol/L)；(5)DADS+miR-200b组(瞬时共转染miR-200b-mimics 40 μmol/L)和DADS(200 μ mol/L)，将转染后的Y79细胞接种于96孔板，每组设置5个复孔，细胞培养临近饱和时，在每孔加入灭菌MTT液20 μl(5 mg/ml)，在孵育4 h后取出，向每孔中加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，随后选择570 nm波长，于酶标仪上测定各孔的吸光值并记录结果，每组实验重复3次。

1.4 Transwell侵袭实验 细胞分组同MTT法，铺适量基质胶稀释液到Transwell小室，过夜成膜，取100 μl(1×105cells/ml)细胞稀释液接种于Transwell小室的上腔，下腔中加入500 μl含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液，放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，36 h后取出，将小室上层细胞用棉签擦弃，磷酸盐缓冲液(PBS)轻洗，4%多聚甲醛固定，结晶祡染色，PBS轻洗，倒置并晾干。光学显微镜下观察，摄像，随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值，每组重复3次。

1.5 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两两间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 DADS对Y79细胞miR-200b表达的影响 采用六种浓度的DADS(0µmol/L、25µmol/L、50µmol/L、100µmol/L、200µmol/L和400µmol/L)分别处理Y79细胞，48 h后收集每组细胞，提取总RNA。qRT-PCR结果显示：与对照组(DADS 0µmol/L)视网膜母细胞瘤细胞Y79中miR-200b的表达量(0.758±0.125)比较，随DADS剂量的增加miR-200b的表达量逐渐上调。DADS浓度不同(25µmol/L、50µmol/L、100µmol/L、200µmol/L和400µmol/L)时，miR-200b的表达量分别为(0.811±0.275)、(1.573±0.101)、(1.956±0.273)、(2.341±0.218)和(2.824±0.242)，差异具统计学意义(P＜0.05)，即DADS可上调Y79细胞中miR-200b的表达，且其呈剂量依赖性。

2.2 DADS通过上调miR-200b抑制Y79细胞增殖 实验分组如方法中所述，在转染48 h后，各组分别与其对应阴性对照组比较。MTT实验结果显示miR-200b组的OD值(0.549±0.057)较miRNA阴性对照组(0.737±0.135)明显降低；DADS组的OD值(0.508±0.064)较DADS阴性对照组(0.722±0.145)明显降低；而DADS+miR-200b组的OD值(0.362±0.081)较miRNA阴性对照组(0.737±0.135)和DADS阴性对照组(0.722±0.145)降低最为显著。差异均具有统计学意义(P＜0.05)，即DADS可以通过上调miR-200b抑制Y79细胞的增殖能力。

2.3 DADS通过上调miR-200b抑制Y79细胞侵袭 实验分组如方法中所述，在转染48 h后，各组分别与其对应阴性对照组比较。Transwell侵袭实验结果显示，转染miR-200b组的Y79的穿膜细胞数(105±13)较miRNA阴性对照组(162±12)明显降低；DADS组的细胞穿膜数(102±13)较DADS阴性对照组(154±8)明显减少；且DADS+miR-200b组的细胞穿膜数(77±8)较miRNA阴性对照组(162±12)和DADS阴性对照组(154±8)减少最显著。差异均具有统计学意义(P＜0.05)，即DADS通过上调miR-200b抑制Y79细胞侵袭。

3 讨 论

视网膜母细胞瘤常发病于五岁以下的儿童，常常由于患者年龄过小，自我辨别能力较弱，大多患儿就诊时实际已发生侵袭或转移，此时的治疗效果常常是有限的，甚至会导致死亡[13]。临床上常用的治疗方法有眼球摘除手术、放射或化学治疗、光凝固治疗等[14]。传统治疗方法除可能存在较大毒副反应，治疗效果也常常是有限的，且眼球摘除手术造成的视力永久性失去是无法恢复的。因此，针对视网膜母细胞瘤的新的抗癌药物的研发与探索也成为了当务之急。

DADS对胃癌、乳腺癌及结肠癌等多种肿瘤具有抑制作用[3-5]。本研究笔者从miR-200b的层面来探讨DADS的抑瘤机制。首先我们用不同浓度的DADS处理视网膜母细胞瘤细胞Y79，提取总RNA后检测miR-200b的表达量，结果显示随着DADS剂量的增加，miR-200b的表达量呈梯度式上调。说明DADS可上调Y79细胞中miR-200b的表达水平且与剂量呈依赖性关系。随后，我们采用MTT实验探索Y79细胞的增殖能力，DADS处理后，Y79细胞的增殖能力明显降低，且miR-200b和DADS共同处理后细胞的增殖能力降低最为显著，说明DADS能够通过上调调miR-200b从而抑制Y79细胞的增殖。最后，我们也采用Transwell侵袭实验来检测Y79的穿膜能力，DADS处理后细胞穿膜数明显减少，miR-200b和DADS共同处理后Y79的穿膜数减少最显著，说明DADS能够通过上调miR-200b来抑制Y79细胞的侵袭。证实DADS可通过上调miR-200b的表达水平抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长及侵袭。

本次研究从miRNA-200b层面来探讨DADS在视网膜母细胞瘤中的抑瘤机制，证实DADS可通过上调miR-200b的表达抑制视网膜母细胞瘤的生长及侵袭，即DADS可潜在的靶向miR-200b治疗视网膜母细胞瘤，为视网膜母细胞瘤的防治提供了新的思路，也进一步阐明了miR-200b和DADS在视网膜母细胞瘤可能的生物学功能。

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Suppression of diallyl disulfide on the proliferation and invasion of retinoblastoma cells by up-regulating miR-200b.

LIU Yue-feng1,ZHANG Yong1,ZHONG Xiao-dong1,LUO Wei-min2.Department of Ophthalmology1, Department of Cardiothoracic Surgery2,the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei, CHINA

Objective To explore the internal molecular mechanisms related to miR-200b for the suppressing effect of diallyl disulfide(DADS)on the proliferation and invasion of retinoblastoma cells.MethodsThe expression of miR-200b regulated by different dose of DADS(0µmol/L,25µmol/L,50µmol/L,100µmol/L,200µmol/L and 400µmol/L)in Y79 cells was detected by quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR).The proliferation and invasion ability of Y79 cells in vitro regulated by miR-200b and DADS were assessed by MTT and Transwell invasion assays,with five groups set up∶miRNA-negative control group(transient transfection with scramble 40 μmol/L);miR-200b group(transient transfection with miR-200b-mimics 40 μmol/L);DADS-negative control group(mock group,DMSO 40 μmol/L);DADS group(DADS 200 μmol/L)and DADS+miR-200b group(transient transfection with both miR-200b-mimics 40 μmol/L and DADS 200 μmol/L).ResultsmiR-200b expression was increased with the increase of the doses of DADS,in a dose-dependent manner(P＜0.05).For MTT,the OD value was significantly lower in miR-200b group than miRNA-negative control group[(0.549±0.057)vs(0.737±0.135)],in DADS group than DADS-negative control group[(0.508±0.064)vs(0.722±0.145)],and the OD value in DADS+miR-200b group was the lowest[(0.362±0.081)].The differences were all statistically significant(P＜0.05).The results indicate that DADS could inhibit the proliferation capacity of Y79 cells by increasing the expression of miR-200b.In Transwell invasion assays,the number of cells penetrating membrane was significantly less in miR-200b group than miRNA-negative control group[(105±13)vs(162±12)],in DADS group than DADS-negative control group[(102±13)vs(154±8)],and the number in DADS+miR-200b group was the lowest[(77±8)].The differences were all statistically significant (P＜0.05).The results indicate that DADS could inhibit the invasion capacity of Y79 cells by increasing the expression of miR-200b.ConclusionDADS can suppress the proliferation and invasion of human retinoblastoma cells by up-regulation of miR-200b.

Retinoblastoma;MiR-200b;Diallyl disulfide(DADS);Proliferation;Invasion

R739.7

A

1003—6350（2016）03—0351—03

2015-09-11)

湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(编号：B2015477)；湖北省十堰市科技课题(编号：14Y40)

罗卫民。E-mail:luoweimin0803@sina.com