遗传性泛发性色素异常症遗传学研究进展

房小凯 孙青

遗传性泛发性色素异常症遗传学研究进展

房小凯 孙青

遗传性泛发性色素异常症以常染色体显性遗传模式为主，也可表现为常染色体隐性遗传。近年来该病的分子遗传学研究取得较大进展，找到3个不同致病区域，分别为6q24.2-q25.2、12q21-q23和2q35。发现2q35上的ATP结合盒亚家族B成员6为该病的致病基因，进一步通过基因功能证实，免疫组化显示，ABCB6抗体在上皮细胞质中弥散性分布，蛋白免疫印迹显示，ABCB6在黑素细胞和角质形成细胞中有表达，斑马鱼实验证明了ATP结合盒亚家族B成员6在色素代谢方面起重要作用。目前报道，遗传性泛发性色素异常症的ABCB6基因突变位点共8个，包括1个移码突变，7个错义突变。

细胞遗传学；基因，ABCB6；突变；遗传异质性；遗传性泛发性色素异常症

遗传性泛发性色素异常症（DUH）是一种常染色体显性遗传性皮肤病，常于婴儿期或幼儿早期发病，表现为分布躯干和四肢的泛发性色素沉着斑和减退斑，有时可累及面部，斑片大小不一、形状不规则，一般无瘙痒或疼痛，可伴发血小板减少［1］和结节性硬化［2］等疾病。在不同种族家系中，DUH的致病区域曾分别被定位于 6q24.2-q25.2［3］、12q21-q23［4］、2q35［5］上，近期其致病基因被证实为2q35上的ATP结合盒亚家族B成员6（ABCB6）。

1 DUH致病基因定位与克隆

DUH病例在世界各个地区均有报道，其中亚洲的病例较多。DUH大多呈常染色体显性遗传模式，在中国、日本和印度等国家多有报道［3，6］，但在沙特阿拉伯［4］和印度［7］等地区曾报道过常染色体隐性遗传的 DUH 家系，同时在突尼斯［8］、高加索地区［9］、非裔美州人中［10］和亚洲大部分地区［11］均有散发病例，其中不乏父母为近亲结婚的病例。

1.1 致病基因定位于6q24.2-q25.2区域：2003年，Xing等［3］研究了两个中国遗传性对称性色素异常症（DSH）家系，患者表现为面颈部、躯干和四肢大小不同的色素沉着和减退斑，利用连锁分析方法，在6q24.2-q25.2上的10.2 Mb区间内发现最大LOD值10.64，认为该区域是DSH的致病区域。Miyamura等［12］认为，Xing 等［3］研究的患者实际上是 DUH 患者，因为患者几乎全身皮肤都有色素异常斑，其皮损特征符合DUH的临床特点，同时将DSH致病基因定位于1q21.3上的ADAR基因。6q24.2-q25.2被认为是最早确定的DUH致病区域。

1.2 致病基因定位于12q21-q23区域：Stuhrmann等［4］对一个具有4例患者和3例健康个体的沙特阿拉伯DUH家系进行一项以区分DUH与DSH为目的的研究时，在排除DSH的致病基因ADAR基因突变以后，通过以单核苷酸多态性（SNP）为基础的全基因组关联研究，在常染色体隐性遗传模式下，确定了导致该病的新致病区域为位于rs1921045和rs2373584之间的12q21-q23区域，最大LOD值为3.4，区域跨度18.9cM，由此得出了DUH的隐性遗传机制，并证明DSH和DUH是两种遗传病。

作者单位：250012 济南，山东大学医学院（房小凯）；山东大学齐鲁医院皮肤科（孙青）

值得一提的是，关于家族性进行性色素沉着和色素减退症（FPHH）的研究也涉及此染色体区域。FPHH被认为是低外显率的常染色体显性遗传病。临床表现为自出生后即有，随年龄逐渐加重，表现为全身弥漫性分布的棕色或深棕色斑或色素减退斑，间有点状或岛屿状正常皮肤区，有牛奶咖啡斑。FPHH有别于家族性进行性色素沉着症（FPH），FPH无色素减退特征，且在组织学表现上与DUH很接近。Amyere等［13］对7个FPHH家系进行全基因组连锁分析，发现致病区域为12q21.12-q22，与DUH致病区域12q21-q23部分重叠。进一步发现此区域上KITLG基因在4个家系中存在3个不同突变，2个FPHH家系中出现的1个突变曾被报道过为FPH突变，而另2个p.Val33Ala和p.Thr34Pro未曾在FPH或其他疾病中发现，所有的3个突变均发生在KITLG基因的保守β链上。总之，单个基因的突变能导致不同的色素异常疾病，如FPH、FPHH以及类似DUH症状的疾病，因此，可以确定KITLG基因是皮肤色素调节的重要基因。

1.3 致病基因定位于2q35区域：2013年，Zhang等［5］首先将DUH的致病基因定位在2q35区域上的ABCB6基因。并对1个中国常染色体显性遗传DUH家系进行连锁和单倍体分析，排除其致病基因在两个已知区域6q24.2-q25.2和12q21-q23的可能性后，采用全基因组微卫星标记扫描，经过连锁和单倍体分析，发现其致病基因位于D2S325和D2S126之间，在D2S2382处得到最大LOD值3.49，将其定位在2q33.3-q36.1区域。同时，还对该家系中2例患者和1例健康人进行全基因组外显子测序，经公共数据库（dbSNP129、千人基因组计划、HapMap和YH数据库）排查，发现2例患者存在的29个相关变异中，只有2个突变，ABCB6上c.1067T＞C和ZNF142上c.2584C＞T在2q33.3-q36.1区域。为确定致病突变，利用ABI3730XL DNA分析仪进行了Sanger测序，经共分离分析发现，只有ABCB6基因上外显子5的突变c.1067T＞C仅发生于患者，健康人则不发生。另一个突变，ZNF142上外显子8的突变c.2584C＞T则被共分离分析所排除，并被证实与加州大学圣克鲁兹分校基因组网站最新发布的SNP位点相同。结果说明，ABCB6是DUH的致病基因。

近期，Liu等［14］分别通过全基因组连锁，外显子测序和Sanger测序确认了这一结果。首先采用Illumina 660W-Quad BeadChip芯片，对1个中国常染色体显性遗传模式DUH家系中的12个个体进行全基因组关联分析，在 2q34-2q37、10q25、13q12-13q14、17q25和20p12这5个染色体区域内得到最大LOD值为1.81，经单倍型分析，其连锁区间在4 MB到24 MB之间。随后对家系1的4例患者进行全基因组外显子测序，当只考虑非同义和拼接位点单核苷酸变异时，4例患者中共有4 625个单核苷酸变异，其中98个不在千人基因组计划或dbSNP数据库中，只有chr2:220079139在4例患者中杂合，并且单倍型共分离分析定位于关键连锁区域，这个编码突变（c.1358C＞T;p.Ala453Val）位于ABCB6基因的外显子7上，功能预测显示其将被SIFT和PolyphenⅡ破坏。为了证实这个突变位点，对家系1中的13个体ABCB6基因的所有外显子进行Sanger测序，在5例患者中，此突变是杂合的，而在8例健康个体和1 016例健康人中未发现ABCB6基因外显子7突变。同时还对另外4个DUH家系和2例散发病例的ABCB6基因的所有外显子和内含子进行了Sanger测序。在其中1个家系患者中，发现外显子4上的编码突变（chr2:220081092，c.964A＞C;p.Ser322Lys），在这个家系的健康人、其他3个家系和散发病例中，均未发现ABCB6突变，说明DUH存在遗传异质性。

Cui等［15］同样证实了该结果，在对 1个具有21例患者，14例健康人的DUH家系和3例散发的DUH病例，采用Affymetrix GeneChip进行全基因组关联研究，通过连锁分析在染色体2q35-q37.2区域发现最大LOD值4.68。同时，对家系中的3例患者和1例健康个体进行了外显子测序，用外显子数据库进行序列数据分析过滤后，3例患者仍有39个SNP和17个缺失或插入共56个变异型，其中4个发生杂合突变的基因USP40、ABCB6、SLC11A1和NCL被选为候选基因，USP40、SLC11A1和NCL被Sanger测序排除，而ABCB6基因上c.1663 C＞A,p.Gln555Lys突变被证实。在1个散发病例中发现ABCB6基因上突变g.776 delC,c.459 delC，另外2个散发病例则未发现ABCB6基因突变。

2 致病基因的功能验证

上述研究证实了DUH致病基因为ABCB6基因，其位于2q35上，共有19个外显子，编码的膜相关蛋白是ATP结合盒超家族（ABC）转运蛋白基因的一种。ABC蛋白运输不同的分子进出细胞膜，分为 7 个不同的亚家族：ABC1、MDR/TAP、MRP、ALD、OABP、GCN20、White 和 ABCB6 蛋白是 MDR/TAP亚家族的一种，包含842个氨基酸，有8个跨膜区域，存在于细胞质膜和细胞器中。Kiss等［16］用共聚焦显微镜、电子显微镜等多种显像方式，确定ABCB6蛋白通过胞吞作用进入质膜并存在于溶酶体中。Chavan 等［17］发现，ABCB6 可通过在细胞质和线粒体间运输粪卟啉原Ⅲ调节亚铁血红素的合成，并证明线粒体ABCB6蛋白和其运输机制有直接关系。报道称ABCB6的错义突变还可导致假性高钾血症（p.R375Q）［18］和视力缺损（p.A57T和 L811V）［19］。

近期研究从基因不同功能层面上验证了ABCB6在DUH中的作用。首先是mRNA表达，Liu等［14］在4例携带ABCB6突变的DUH患者和4例健康人的皮肤组织中，用实时定量反转录PCR的方法，研究了ABCB6 mRNA的表达，发现两者间表达差异无统计学意义。

为分析ABCB6蛋白在细胞和组织中的定位，Liu等［14］对1例患者和健康人的石蜡包埋皮肤组织进行了免疫组化分析，在人表皮黑素细胞中，发现了ABCB6蛋白表达，在基底层角质形成细胞中无表达，未发现患者与健康人间有明显表达差异，分析可能只是ABCB6的亚细胞定位不同而非表达水平有差异。Zhang等［5］对于ABCB6在人类上皮细胞中的表达进行了免疫组织化学分析和蛋白免疫印迹研究。为了检测ABCB6在皮肤中的表达水平，对正常腹部皮肤进行免疫组织学染色，发现ABCB6的多克隆抗体在上皮细胞质中弥散性分布。蛋白免疫印迹研究显示，ABCB6在HaCaT和A375细胞中表达，明确了ABCB6在黑素细胞和角质形成细胞中有表达。Cui等［15］同样在前期确定致病基因ABCB6基础上，对中国的1个DUH家系和3例散发病例ABCB6基因进行组织病理学、电镜观察和免疫组化分析，将具有c.1663 C＞A和c.459 delC突变的皮损组织和正常个体的皮肤组织用ABCB6的单克隆抗体免疫染色，发现黑素细胞对ABCB6表现出活跃的免疫反应性。

为进一步分析ABCB6在细胞中的定位。Zhang等［5］用免疫荧光染色检查了野生型和小鼠B16细胞株中的突变ABCB6蛋白亚细胞定位，3种突变的ABCB6（p.Ser170Gly,p.Leu356Pro,和 p.Gly579Glu）用加强绿色荧光蛋白融合蛋白标记后，分别反转录入小鼠的B16细胞，经共聚焦显微镜观察，野生型ABCB6定位在核内体部分，可以清楚地观察到在树突中聚集。而突变的ABCB6聚集在细胞核周围区域的高尔基体内，不在树突区。

动物实验也验证了ABCB6在发病中的作用，Liu 等［14］对斑马鱼的 ABCB6 基因同系物（zABCB6）中的外显子6和8（等同于人类的ABCB6外显子4和7）进行抑制分析。在活下来的胚胎中并未发现形态学异常，在发育中的胚胎里，黑素细胞发生变异变成斑块状的成熟黑素细胞，未经抑制的明显比抑制的胚胎有更多成熟黑素细胞。为了确定ABCB6突变体中成熟黑素细胞减少的突变表现型是ABCB6表达抑制的特殊反应，将ABCB6突变体与标准长度的hABCB6 mRNA转录物共注射，发现对于部分ABCB6突变表现型，共注射是可以恢复表型的，接受共注射的胚胎明显有更高的成熟黑素细胞水平，进一步证明了ABCB6在色素代谢方面的重要作用。

3 致病基因的突变检测

据文献检索，目前已发现，ABCB6上DUH的突变位点共 8 个［5，14-15，20］，包括 7 个错义突变，1 个移码突变，均发生在进化保守的氨基酸上，全部来自于中国的家系和散发病例。除前面描述的突变位点外，近期Lu等［20］在4个DUH家系和 2例DUH散发病例中发现了2个突变位点，分别为外显子6上c.1270T＞C（p.Y424H）、外显子 4上 c.964A＞C（p.Ser322Lys）。其中 c.964A＞C与 Liu 等［14］发现的突变位点相同。

4 结语

目前研究已发现了DUH的3个致病区域，且在其中2q35区域中发现了致病基因ABCB6，并经功能学试验证实，同时也发现该病有明显的遗传异质性。随着分子生物学、分子遗传学等学科的不断发展，多种基因测序和功能研究的方法逐渐成熟，对于DUH遗传学的研究也将更一步深入，而随着更多致病基因和突变位点的发现，将了解DUH的更多遗传特征，为临床实现对于DUH的基因治疗提供依据。

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Genetic advances in dyschromatosis universalis hereditaria

Fang Xiaokai*,Sun Qing.*Shandong University School of Medicine,Jinan 250012,China

Dyschromatosis universalis hereditaria （DUH） is inherited mainly in an autosomal dominant manner,sometimes in an autosomal recessive manner.In recent years,great progress has been made in molecular genetics of DUH.Three pathogenic genetic loci have been reported to be associated with DUH,including 6q24.2-q25.2,12q21-q23 and 2q35.The ATP-binding cassette,sub-family B,member 6 （ABCB6）gene at2q35 has been identified as a pathogenic gene forDUH by gene function analysis.Immunohistochemical studies showed that anti-ABCB6 antibodies were diffusely distributed in the cytoplasm of epithelial cells,Western blot analysis revealed that ABCB6 was expressed in melanocytes and keratinocytes,and zebrafish assays demonstrated that ABCB6 played an important role in pigment metabolism.By now,8 mutations of the ABCB6 gene have been reported in patients with DUH,including 1 frameshift mutation and 7 missense mutations.

Cytogenetics; Genes, ABCB6;Mutation;Genetic heterogeneity;Dyschromatosis universalis hereditaria

Sun Qing,Email:sunqing7226@163.com

2015-03-11）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.02.010

孙青，Email:sunqing7226@163.com

本文主要缩写：DUH：遗传性泛发性色素异常症，ABCB6：ATP结合盒亚家族B成员6，DSH：遗传性对称性色素异常症，SNP：单核苷酸多态性，FPH：家族性进行性色素沉着症，ABC：ATP结合盒超家族，FPHH：家族性进行性色素沉着和色素减退症