成分敲除技术在中药药效物质基础研究中的应用＊

邵 晓，朱珂璇，张 蔷，赵玉男

（南京中医药大学基础医学院实验研究中心 南京 210046）

成分敲除技术在中药药效物质基础研究中的应用＊

邵 晓，朱珂璇，张 蔷，赵玉男＊＊

（南京中医药大学基础医学院实验研究中心 南京 210046）

中药药效物质基础研究是实现中药现代化的关键问题之一。近年来，中药药效物质基础的研究逐渐引入成分敲除技术，主要包括色谱敲除法和抗体敲除法。该类方法可以探讨同一成分在不同中药中的作用贡献，以及不同成分在同一中药中针对不同活性的作用贡献，并对此进行主次区分与排序，从而获得新的研究结果。成分敲除技术的运用，不仅有助于从全新的角度理解中药药效物质基础和制定科学的质量控制标准，而且有助于理解中药单味药内部不同成分之间“配伍”的现代科学意义。

中药 药效物质基础 成分敲除 色谱敲除法 抗体敲除法

随着现代医药科学技术的飞速发展，中药药效物质基础研究已成为当下的研究热点[1]。中药药效物质基础研究不仅阐明了中药作用的原理，而且为控制中药的质量打下了坚实的基础。中药从古至今一直被广泛运用并且有着确切的疗效，其中所含的复杂物质基础便是发挥作用的关键[2]。众所周知，中药是一个复杂体系，即使是单味中药，其本身也由多样性成分构成， 影响其质量的因素更为复杂多样。研究表明：中药多种成分之间存在着协同拮抗等相互作用，即中药中某个单体成分在干预动物或人体时必然受到其它成分药理和药效作用的影响[3]。中药特定药效作用的物质基础是其所含的化学成分，因而全面评价中药质量的关键是对产生药效的特定化学成分的检验。目前，开展中药化学成分与其功效间关联度的研究思路主要是通过对不同途径获得的化学成分进行药理活性或药效评价，以该评价结果作为判断其是否与中药整体功效主治相关。但该研究思路仅用于推测某一单体成分与中药功效间是否存在相关性，并不能为其在整体药效作用中的贡献度提供直接的证据。最近，在基因敲除研究模式的影响下，成分敲除技术（Ingredient Knock-Out Technology）被逐渐引入到中药药效物质基础的研究中。成分敲除技术，包括色谱敲除法和抗体敲除法，指的是在研究某一特定成分的功能时，将目标成分从复合物中敲除，并通过对比分析成分敲除前后复合物药效的变化来揭示该成分的作用，可以探讨同一成分在不同中药中的作用贡献，以及不同成分在同一中药中针对不同活性的作用贡献，并对此进行主次区分与排序，从而获得新的研究结果。成分敲除技术的运用，不仅有助于从全新的角度理解中药药效物质基础和制定科学的质量控制标准，而且有助于理解中药单味药内部不同成分之间“配伍”的现代科学意义。

1 色谱敲除法

1.1 研究思路

制备液相色谱系统可应用于中药研究中化学成分的分离和纯化，其原理是通过混合物中各成分物理化学性质的差异，使其不同程度地分布于两个不相溶的相中，并在两相的相对运动过程中发生多次分布以达到分离的目的[4]。研究显示，现代制备液相色谱系统的收集及分离技术成熟且具有较高的效率，可用于剔除中药中某个单一成分或化学特征部位。

1.2 应用实例

红花是活血化瘀的传统中药，其现代药理研究表明：红花可以降低细胞氧化损伤，具有较好的抗氧化活性，治疗脑缺血、心肌缺血等心脑血管疾病与红花的抗氧化活性密不可分[5-7]。王林艳等[8]把抗氧化效应评价与制备液相剔除技术相结合，并在该基础上，寻找到一种新颖有效的中药效应物质研究方法。该方法在一定程度上显示了中药的不同成分在发挥作用的过程中所体现出来的成效以及成效的多少。研究表明，红花中分离出的有效成分6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷，羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B等是对红花抗氧化活性有重要贡献，可直接发挥红花的抗氧化活性，还可通过结合其他成分间接地发挥红花的抗氧化活性。

Gong A G等[9]通过液相色谱分离出当归补血汤中的黄芪关键成分毛蕊异黄酮，化学结构类似β-雌二醇。相关研究发现，当归补血汤具有促进雌激素、血红素及骨细胞生成的作用，日常服用可以用来治疗妇女更年期综合征。比较原方和剔除毛蕊异黄酮后的功效，发现后者在细胞实验中促进雌激素、血红素及骨细胞生成的作用显著降低。不过，在细胞实验中单独使用毛蕊异黄酮也未取得明显上述作用。由此推测，毛蕊异黄酮在当归补血汤中的作用主要是协调汤剂中多种药理成分以达到最大的生物化学效应。

2 抗体敲除法

2.1 基本原理

中药化学成分复杂，用抗体敲除法研究药物成分与功效间关联度的原理类似于“基因敲除”。“基因敲除”是指在研究某一特定基因的功能时，将目标基因从全基因中敲除，并通过对比分析基因敲除前后生理效应的变化来揭示该基因的功能。研究证明，基因敲除技术已被广泛应用于研究特定基因功能的有效途径。同样研究中药中某一特定成分在整体药味中的作用可以通过比较分析将其敲除前后中药功效的变化，以揭示该中药成分与整体药物功效之间的相关性。

2.2 技术策略

采用生物技术手段制备中药小分子单克隆抗体，结合免疫亲和色谱特异性敲除/剔除提取物中某个有效成分进行中药药效物质基础的研究技术。研究表明，该技术策略不仅将中药复方中关键的有效成分及具有协同作用的天然成分的作用理清，并且在中药药效物质基础研究中发挥不可或缺的作用[10]。

2.3 小分子单克隆抗体技术

2.3.1 小分子半抗原

小分子物质（即半抗原）指的是相对分子质量小于5 000的分子。由于小分子物质没有免疫原性，不具有独立激发人或动物体内产生抗体的作用，需与大分子物质偶联生成人工抗原免疫人或动物，才能使人或动物产生免疫应答产生相应抗体[11]。目前国内外众多学者较为全面的研究了基于单克隆抗体的小分子免疫分析方法，建立了多种小分子半抗原的合成方法，并初步应用于环境监测、食品农药残留及毒品快速测定中[12-14]。

2.3.2 免疫亲和色谱

免疫亲和色谱柱技术通过将抗体连接臂结合在固相介质上，使抗体与其有生物特异亲和性的抗原分子相结合，从而达到分离纯化的目的。研究表明，免疫亲和色谱柱技术已在抗体纯化等方面广泛应用[15]。因此，小分子单克隆抗体技术即通过具有中药活性成分的单克隆抗体制备相应的免疫亲和色谱柱，从而特异性地敲除药材或复方中该化合物的某一成分以达到纯化的目的。

2.4 应用实例

陈亮等[16]利用抗体敲除技术将柚皮苷从经典方剂四逆散中剔除。主要过程如下：①合成柚皮苷的完全抗原：柚皮苷与牛血清白蛋白的结合物；②获得抗血清即通过合成的完全抗原对新西兰兔进行免疫；③制成免疫亲和色谱柱：将获得的抗血清纯化后与经 CNBr 活化的Sepharose 4B 凝胶共价偶联；④上样：上样于亲和色谱柱，上样液为四逆散样品提取物；⑤洗脱：获得特异性剔除柚皮苷的四逆散样品。

人参的主要活性成分是人参皂苷，单克隆抗体技术可以用于制备其敲除提取物并研究其生物活性[17]。研究表明：人参皂苷Re及西洋参浆果提取物均可将小鼠禁食血糖的水平大幅度降低；而西洋参浆果提取物在剔除掉人参皂苷Re之后其降血糖效应大大减少，从而提示西洋参浆果提取物中拥有显著降血糖效应的成分是人参皂苷Re[18]。除此之外，人参皂苷Re的提取物制备为检验人参皂苷Re在治疗糖尿病和肥胖中的重要性亦提供了一种理想的方式[19]。

屈会化等[19]采用免疫亲和色谱柱技术特异性敲除了葛根药材提取物中的葛根素，并研究了人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC）分泌内皮素-1（Endothelin 1，ET-1）水平在葛根素敲除前后的影响，其研究结果表明：葛根总提取液与特异性敲除葛根素后的葛根提取液之间，葛根素纯品与特异性敲除葛根素后的葛根提取液之间均存在显著性差异（P＜0.05，P＜0.01），而葛根总提取液与葛根素纯品无明显差异（P＞0.05），提示HUVEC分泌ET-1的水平与葛根素的生物效应密切相关，证明了葛根素与葛根功效之间具有明确的相关性。

Uto T等通过抗体敲除法研究了甘草在特异性敲除甘草皂苷前后对一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）蛋白水平的影响。研究结果显示：甘草提取物可以抑制内毒素刺激巨噬细胞释放NO和诱导型NO合酶的表达；剔除甘草皂苷后的抑制作用较甘草提取物有了显著的减少；而单独给予甘草皂苷却无抑制作用。以上研究结果表明，甘草皂苷对甘草提取物中的其他成分发挥抑制巨噬细胞诱导型NO合酶的表达有一定的协同作用[20，21]。

表1 色谱敲除法和抗体敲除法的比较

3 小结

中药广泛应用于疾病的预防和治疗，快速分离纯化技术对于理解中药复杂的物质基础、控制中药质量和发现潜在活性物质具有重要意义，也是目前中药研究的热点问题之一[22]。成分敲除技术具有明显的中医药特色且高效精准，具体表现为该技术可将中医药理论的整体观、系统观运用于实际，并突显中医药多成分协同拮抗的丰富内涵。中医药特色指该模式始终把中医方药作为一个整体或系统思考，且该模式可又好又快地辨别中药谱效关系和量效关系的真实性，并在此基础上实现中药（化学）质量标准的研究。因此，中药成分在治疗及应用过程中的具体效应可通过敲除技术的广泛运用进一步探查。中药一般多以同母核结构形式存在（类似物），各成分之间的活性差异有时未必很大，即多表现出集成效应。研究中如果出现去掉某一成分后药效影响很大，可说明该成分是发挥药效的关键成分，应在质量标准制定时重点设定；如果出现药效影响不大的现象，说明该成分的效应可被其它类似物所取代，且与其它结构类似物之间不产生协同作用，可不作为质控的指标成分（特征性成分除外）。

目前，成分敲除技术国内外已陆续应用于药效物质基础的研究，不过相关研究的数量偏少，未来有很大的发展空间。在研究中是采用色谱敲除法还是抗体敲除法，由于实践的相对匮乏，因此提出客观的评述是困难的。不过，基于这两种敲除法的原理，可初步分析得到两者的适用范围和优缺点（表1）。抗体敲除法采用的是免疫亲和色谱，因此整个制备过程需要在水相中完成，仅适用于水溶性较强的小分子或大分子化合物的敲除，不如色谱敲除法适用范围广。不过，由于采用的是抗体和抗原之间的特异性结合原理，抗体敲除法天然选择性高，抗体大规模制备成本相对低；而色谱敲除法的选择性受制于敲除化合物与其它化合物之间的分离效果，并需要专门的制备液相色谱系统。未来需要更多的实践来验证这些适用范围和优缺点；如果属实，那么如何拓展适用范围以及克服优缺点是需要进一步研究的方向。

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Application of Ingredient Knock-Out Technology in Pharmacodynamic Material Basis Research of Traditional Chinese Medicine

Shao Xiao, Zhu Kexuan, Zhang Qiang, Zhao Yunan
(Research Center, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

Studies on pharmacodynamic material basis are critical for the development of traditional Chinese medicine. Recently， ingredient knock-out technologies， including chromatography knock-out and antibody knock-out， were introduced to recent experimental studies. It was adopted for understanding the effects of the same ingredient in different herbal medicines and of different ingredients in the same herbal medicine. The ingredients were sorted distinctly and some new findings were obtained. So the utilization of ingredient knock-out technology not only brought a new perspective of comprehending pharmacodynamic material basis of traditional Chinese medicine and formulating appropriate criteria of quality control， but also was beneficial to understand the scientific significance of “compatibility” between different ingredients within a single herbal medicine in modern sense.

Traditional Chinese medicine， pharmacodynamic material basis， ingredient knock-out，chromatography knock-out， antibody knock-out

10.11842/wst.2016.09.021

R966

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-09-20

修回日期：2016-09-20

＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（81303246）：脑局部糖原代谢在人参总皂苷抗应激致海马结构可塑性损伤中的作用研究，负责人：赵玉男；江苏高校优势学科建设工程资助项目（中西医结合），负责人：黄熙。

＊＊ 通讯作者：赵玉男，副教授，主要研究方向：中药药理学。