基于斑马鱼模型探讨马钱子的抗血管生成活性＊

倪媛媛，赵崇军，冯娅茹，田敬欢，张文婷，夏 青，樊娇娇，马志强，林瑞超

（北京中医药大学中药学院 中药品质评价北京市重点实验室 北京 100102）

基于斑马鱼模型探讨马钱子的抗血管生成活性＊

倪媛媛，赵崇军，冯娅茹，田敬欢，张文婷，夏 青，樊娇娇，马志强＊＊，林瑞超＊＊

（北京中医药大学中药学院 中药品质评价北京市重点实验室 北京 100102）

目的：以斑马鱼为模型，探讨马钱子的抗血管生成活性。方法：以Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼和野生斑马鱼为模型，在安全浓度范围内，分别采用荧光显像和体内碱性磷酸酶定量检测的方法，以PTK787为阳性对照，考察马钱子水提取物对斑马鱼血管生成的抑制作用。结果：与空白对照组比较，在一定的浓度范围内，低浓度的马钱子水提取物能抑制Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼的节间血管生成，随着提取物浓度的增加抑制作用更加明显，抑制作用呈剂量依赖性。在碱性磷酸酶定量检测实验中，马钱子水提取物浓度为25 μg·mL-1时，血管生成抑制率为8.61%；浓度为100 μg·mL-1时，血管生成抑制率为26.16%；在一定的浓度范围内，马钱子处理组均表现出显著的抗血管生成活性（P＜0.05），血管生成抑制率与马钱子水提取物浓度成线性关系。结论：马钱子水提取物可以有效的抑制斑马鱼血管生成，有明显的抗血管生成活性。

马钱子 斑马鱼 抗血管生成 荧光显像 碱性磷酸酶定量

马钱子为马钱科植物马钱Strychons nux-vomica L.的干燥成熟种子，具有通络止痛，散结消肿的功效，用于治疗跌打损伤，骨折肿痛，风湿顽痹，麻木瘫痪，痈疽疮毒，咽喉肿痛[1]。马钱子的主要成分生物碱既是有效成分也是毒性成分[2]。现代药理研究表明，马钱子具有抗心律失常、抗血栓、抗炎免疫[3]、抗肿瘤[4]等药理作用，其中，抗肿瘤作用最引人注目。

作为一种模式生物，斑马鱼具有饲养繁殖容易、胚胎发育迅速等特点，被广泛应用于遗传学和发育生物学研究。近些年，斑马鱼逐渐被应用于中药活性、毒性成分的高通量筛选[5]。在胚胎发育早期，斑马鱼具有光学透明性，且血管的生成模式比较简单，主要出现在头部和躯干部体节间[6]，可以在显微镜下直接观察其血管的生成情况而不需要复杂的解剖。此外，血管内源性碱性磷酸酶染色能够进一步确定药物的抗血管生成活性，该方法简单易行。因此，斑马鱼已经成为一种理想的抗血管生成药物的筛选模型。

本实验以Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼和野生斑马鱼为模型，分别采用荧光显像和体内碱性磷酸酶定量检测的方法，以PTK787为阳性对照，观察斑马鱼节间血管生成数目，测定体内碱性磷酸酶含量，探讨马钱子水提取物的抗血管生成活性。

1 实验材料

1.1 主要仪器与试药

TE-2000-S型光学倒置显微镜（日本尼康公司）；BX51荧光显微镜（日本奥林巴斯集团）；200 μL、1 mL、5 mL移液器（德国Eppendorf公司）；LRH-250Z型恒温生化培养箱（广州沪瑞明仪器有限公司）；RJLDL-50G型离心机（无锡瑞江分析仪器有限公司）；HZQ-QX型全温振荡箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；Epoch酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；HQ10-20H超纯水仪（长沙聚丰环保科技有限公司）；塑料吸管（江苏天力医疗器械有限公司）。

马钱子为安国圣山药业有限公司提供，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为马钱科马钱属植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子。PNPP（北京拜尔迪生物技术有限公司）；二乙醇胺缓冲液（美国Thermo Scientific公司）；无水乙醇、NaOH、Na2HPO4、KCl、K2HPO4、MgSO4、NaCl、NaHCO3均为分析纯（北京化工厂）；CaCl2（德国Sigma公司）；麻醉剂（MS222，德国Sigma公司）；水为超纯水；琥珀酸瓦他拉尼（PTK787）（上海瀚香生物科技有限公司，批号：201605129）。

1.2 实验动物

实验用Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼和野生斑马鱼亲鱼均来源于中国科学院水生生物研究所，并在本实验室进行饲养繁殖。饲养条件如下：水温控制在28±1℃，pH=7-7.2，电导率400-500 μs·cm-1，光照/黑暗周期为14 h/10 h，养殖系统为爱生牌斑马鱼养殖系统。

2 实验方法

2.1 马钱子样品制备及分组

2.1.1 斑马鱼胚胎培养液

按 照Zebrafish Book标 准 配 制：0.25 mol·L-1Na2HPO4、0.137 mol·L-1NaCl、0.44 mol·L-1K2HPO4、5.4 mol·L-1KCl、4.2 mol·L-1NaHCO3、1.0 mol·L-1MgSO4、1.3 mol·L-1CaCl2的含4%亚甲基蓝的水溶液。

2.1.2 药物的制备

称取25 g的马钱子生品，粉碎后过40目筛，加入10倍量的水加热回流提取2次，每次1 h，过滤，5 000 r·min-1离心30 min，上清液浓缩干燥，贮存备用。

2.1.3 马钱子水提取物溶液的配制及分组

准确称取0.01 g的马钱子水提取物粉末，研磨，溶于50 mL的胚胎培养液中，超声30 min，配制成200 μg·mL-1的母液，用胚胎培养液将母液稀释至所需浓度，即为马钱子组；0.1 μg·mL-1PTK787为阳性对照组；等体积的胚胎培养液为空白对照组。

2.2 马钱子水提取物溶液对斑马鱼胚胎发育的影响

在显微镜下选取正常发育受精后6-8 h（post-受精的单词，6-8 hpf）的斑马鱼胚胎，并将其随机转入含有4 mL胚胎培养液或不同浓度马钱子水提取物溶液的12孔板，每2孔为同一药物浓度，每孔25枚胚胎，置于28.5℃恒温生化培养箱中培养。每隔24 h更换马钱子水提取物溶液1次，培育至48 hpf。实验终点，在光学倒置显微镜下观测斑马鱼胚胎心脏发育情况，初步判断马钱子水提取物对斑马鱼胚胎的致畸性。

2.3 血管生成测定

2.3.1 荧光显像的方法

取6-8 hpf的Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼胚胎按2.2项下处理，以PTK787为阳性对照，培育至72 hpf，在实验终点，使用麻醉剂将斑马鱼麻醉，在荧光显微镜下观察斑马鱼体内节间血管生成情况并拍照，评价马钱子水提取物对斑马鱼节间血管生成的抑制作用。

2.3.2 体内碱性磷酸酶定量的方法

取6-8 hpf的野生斑马鱼胚胎按2.2项下处理，以PTK787为阳性对照，培育至72 hpf，参照Huang等[7]的方法进行体内碱性磷酸酶染色，对血管生成进行定量评价，确定马钱子水提取物对斑马鱼血管生成的抑制作用。步骤如下：① 吸除孔板中的马钱子水提取物溶液，用胚胎培养液清洗2次；② -20℃预冷的70 %乙醇水中处理10 min；③ 无水乙醇脱水，渗透30 min；④ 二乙醇胺缓冲液洗3次，每次10 min；⑤ 2 mL 0.5mg·mL-1的PNPP室温振荡孵育 30 min；⑥ 每孔加入500 μL 2 mol·L-1的NaOH，终止反应；⑦ 将反应液（200 μL）置于96孔板中，在酶标仪中测吸光度（OD405）；⑧ 计算血管生成抑制率，公式如下：

2.4 数据处理

应用SAS 9.30统计分析-软件进行数据处理，多组数据均以均值±方差（±s）方式表示，方差分析采用方差分析（ Analysis of Variance，ANOVA )，P＜0.05为统计学显著差异。

3 实验结果

3.1 马钱子水提取物溶液对斑马鱼胚胎发育的影响

在不同浓度马钱子处理组中，斑马鱼胚胎发育至48 hpf 时出现了明显的心包水肿，心率降低，血流速度减慢等症状。以心率为指标评价马钱子水提取物对斑马鱼胚胎心脏发育的影响。结果显示，各处理组与空白对照组，处理组之间均存在显著性差异（P＜0.05）。在一定的浓度范围内，随着马钱子水提取物浓度的增加，斑马鱼心脏毒性越明显（图1）。

图1 马钱子水提取物溶液对斑马鱼48 hpf胚胎心率的影响

3.2 血管生成测定

3.2.1 荧光显像的方法

在荧光显微镜下观察发现，空白对照组斑马鱼体节间血管正常形成，血管红色荧光清晰可见；马钱子处理组斑马鱼体节间血管出现部分缺失或全部缺失；阳性对照组斑马鱼的体节间血管也同样出现了缺失。结果表明，与空白对照组比较，在一定的浓度范围内，低浓度马钱子水提取物能够抑制斑马鱼的节间血管生成数目，随着马钱子水提取物浓度的增加，抑制作用越来越明显（图2）。

图2 马钱子水提取物对Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼血管生成抑制情况

3.2.2 体内碱性磷酸酶定量检测的方法

由于碱性磷酸酶和底物PNPP反应能生成黄色产物，可根据该产物在405 nm处的吸光度来计算斑马鱼体内血管生成情况。选择不同浓度马钱子水提取物溶液处理6-8 hpf斑马鱼胚胎培育至72 hpf，对其体内的碱性磷酸酶含量进行测定。结果显示，当马钱子水提取物浓度为25、50、75、100 μg·mL-1时，斑马鱼血管生成抑制率分别为8.61%、14.53%、22.50%、26.16%，与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。阳性对照组抑制率为14.94%，显著高于25 μg·mL-1马钱子组（P＜0.05），显著低于75、100 μg·mL-1马钱子组（P＜0.05），而50 μg·mL-1马钱子组与阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。一定范围内，随着马钱子水提取物浓度的增加，血管生成抑制作用更加明显，斑马鱼血管生成抑制率与马钱子水提取物浓度呈线性关系：Y=0.2648X+1.118，R2= 0.9856（图3、图4）。

图3 马钱子水提取物对72 hpf斑马鱼胚胎血管生成影响的定量碱性磷酸酶检测

4 讨论

肿瘤的发生、生长和转移与肿瘤新生血管的形成密切相关[8，9]。肿瘤新生血管的形成是以血管生成的方式发生的，若能抑制肿瘤血管生成，则可达到抑制肿瘤生长和转移的目地，因此，“抗血管生成疗法”成为了研究者们寻求肿瘤治疗的新途径[10，11]。在抗血管生成活性药物筛选中，斑马鱼早期血管生成的模式比较简单，显微镜下能够动态观察其逐步延伸的发育过程，并且斑马鱼在血液循环系统严重缺陷的情况下仍能存活7天以上[12]。荧光标记的转基因斑马鱼使得在活体胚胎中筛选抗血管生成活性药物的过程更加直观、快捷[13]，实验结果便于统计、可信[14，15]。此外，斑马鱼模型还能够实现抗血管生成活性化合物的高通量筛选，在一次平行试验中可以对多个化合物同时进行测定，获得高通量的数据且便于系统分析处理[16-18]。总之，斑马鱼在抗血管生成活性筛选中是体内动物模型和体外细胞模型的结合体，不仅能够在整体水平上观察药物对斑马鱼血管的抑制作用，还可以从分子水平探讨影响血管生成的机制，能充分发挥早期活性成分（部位）发现以及化合物活性评价的优势[19]，这对中国现有的抗癌药新药发现和早期筛选模型将会是一个有力的补充，其应用前景十分广阔。

本实验以Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼和野生斑马鱼为模型，在安全浓度范围内，分别采用荧光显像和体内碱性磷酸酶定量的方法，对马钱子水提取物的抗血管生成活性进行评估。结果发现，与空白对照组和阳性对照组比较，低浓度的马钱子水提取物就能够抑制斑马鱼的节间血管生成数目，降低体内碱性磷酸酶的含量，且低浓度的马钱子水提取物具有较显著的抗血管生成活性。该实验进一步证实了马钱子具有抗肿瘤活性，未来能够用于抗肿瘤活性物质的筛选和研发。

本实验中采用的阳性对照药物PTK787是一种新型酞嗪类小分子酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制VEGF的表达来实现抗血管生成作用[20]。虽然，本实验结果表明马钱子水提取物具有抗血管生成活性，但是马钱子水提取物抑制斑马鱼血管生成是否与生长因子水平尤其是VEGF 水平有关，以及抑制斑马鱼血管生成的作用机制尚需进一步研究。此外，马钱子作为毒性较大的中药，对斑马鱼具有明显的毒性，会引发机体出现心包水肿、心率降低、血流速度减慢等症状。从某种程度上来说，我们要确定马钱子的抗血管生成作用是否与细胞毒性相关，为有毒中药的二次开发提供新的思路和方法。

图4 斑马鱼血管生成抑制率与马钱子水提取物浓度的线性关系

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The Anti-Angiogenetic Effect of Strychons Nux-vomica on Zebrafish

Ni Yuanyuan, Zhao Chongjun, Feng Yaru, Tian Jinghuan, Zhang Wenting, Xia Qing, Fan Jiaojiao, Ma Zhiqiang, Lin Ruichao
(Beijing Key Laboratory for Quality Evalution of Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to explore the anti-angiogenetic effect of the seeds of S. nux-vomica on zebrafish. Taking Tg (kdrl:mCherry) zebrafish and wild zebrafish as the models， fluorescence imaging and quantitative endogenous alkaline phosphatase assay in vivo respectively were adopted in the scope of the safe concentration of S. nux-vomica seeds. The angiogenesis activity of S. nux-vomica seeds in zebrafish was investigated taking PTK787 as the positive control. As a result， in a certain range of concentrations， the low concentration of the water extract of S. nux-vomica seeds limited the number of intersegmental blood vessels in Tg (kdrl:mCherry) zebrafish compared with the blank control group. With the increased concentration of the water extract of S. nux-vomica seeds， the anti-angiogenetic effect enhanced in a dose-dependent manner. The quantitative endogenous alkaline phosphatase assay showed that as the concentration of water extract of the seeds of S. nux-vomica was 25 μg·mL-1the anti-angiogenesis effect was 8.61%; and while the concentration was 100 μg·mL-1， the anti-angiogenesis effect was 26.16%. At least for some range of concentrations， the different treatment groups showed that the difference was statistically significant (P ＜0.05)， and the anti-angiogenetic effect was closely associated with the concentration of the water extract of S. nux-vomica seeds in the linear relation. In conclusion， the water extract of S. nux-vomica seeds presented significant anti-angiogenetic effect and effectively suppressed angiogenesis in zebrafish.

Zebrafish， Strychons nux-vomica， anti-angiogenesis， fluorescence imaging， quantitative endogenous alkaline phosphatase assay

10.11842/wst.2016.09.017

R966

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-06-29

修回日期：2016-08-30

＊ 北京市教委共建项目：基于化学成分和斑马鱼特性对有毒中药材进行安全性评价的关键技术研究和应用，负责人：林瑞超。

＊＊ 通讯作者：林瑞超，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中药民族药品质评价、中草药活性成分等；马志强，教授，硕士生导师，主要研究方向：中药药效物质基础研究。