龙胆草中农药嘧霉胺残留动态的研究＊

穆锦江，孙海峰，张帅男

（1. 哈尔滨医科大学附属第二医院 哈尔滨 150081；2. 黑龙江中医药大学药学院 哈尔滨 150040）

龙胆草中农药嘧霉胺残留动态的研究＊

穆锦江1，孙海峰2＊＊，张帅男2

（1. 哈尔滨医科大学附属第二医院 哈尔滨 150081；2. 黑龙江中医药大学药学院 哈尔滨 150040）

目的：建立适合龙胆草中嘧霉胺残留的分析方法，探讨龙胆中嘧霉胺残留和消解规律。方法：本研究首次采用高效液相色谱法研究龙胆中嘧霉胺pyrimethanil的残留动态，对同一批经施药8次的龙胆按不同的时间间隔进行分批采样，优化样品制备方法和色谱条件并进行分析。结果：建立了高效液相色谱法测定龙胆中嘧霉胺残留量的方法，龙胆中嘧霉胺含量随时间消减，消解方程C=1.4569-0.9105exp（59.2146t-2.7442），半衰期为6.65天。结论：本研究建立了利用高效液相色谱法测定龙胆中嘧霉胺残留量的可靠方法，建立的消解方程能准确描述龙胆中嘧霉胺消解规律。通过减少用药次数和交替用药，延长采收的安全间隔期，可以降低农药残留。

嘧霉胺 高效液相色谱法 龙胆 农药残留

龙胆（Radix Gentianae）药材主要来源为龙胆科植物龙胆Gentiana scabra Bag的干燥根及茎[1]。研究显示[2]，斑枯病和叶枯病是龙胆草发生最普遍、危害最重的病害，目前嘧霉胺（施佳乐）是防治这类病害的新型有效药剂，是以处理种苗防治龙胆斑枯病最佳农药，其防效达71.9%，田间施用嘧霉胺800倍液防治效果也很好，防效达到70.3%[3-5]。嘧霉胺是高效、低毒的新型杀菌剂，在农业上主要用于黄瓜、番茄、草莓等灰霉病的防治[6]，目前仅对番茄、青菜、大米、草莓、葡萄等[7]农产品中嘧霉胺残留进行了研究，而有关嘧霉胺在中药材中残留的研究未见报道，在龙胆中嘧霉胺残留量及消解规律的研究尚属空白。本研究采用高效液相色谱法测定龙胆中嘧霉胺的含量，通过建立龙胆药材中残留嘧霉胺的定量分析方法，旨在为龙胆中该药的残留量检测提供科学方法，同时对龙胆嘧霉胺残留动态进行研究，为嘧霉胺的安全使用提供科学依据，为生产符合GAP标准的中药材奠定基础。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器

Pipet-one微量加样移液器（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、旋转蒸发仪及水浴锅（亚荣生化仪器厂）、离心机（LDZ4-0.8，北京医用离心机厂制造）、超声波清洗机（KH5200E型，昆山禾利超声仪器有限公司）、电子天平（AE 240，Mettler）、Agilent 1200高效液相色谱仪和色谱工作站（美国Agilent公司）。

1.2 试剂

98%嘧霉胺标准品（德国拜耳公司，批号：80429）；400 g·L-1施加乐（嘧霉胺）悬浮剂（意大利拜耳作物科学公司）；丙酮、甲醇、正己烷（分析纯，北京益利精细化学品有限公司）；NaCl（上海化学试剂公司）；二氯甲烷（上海现代制药股份有限公司）；无水硫酸钠（江苏省昆山市年沙助剂厂）；石英砂、饱和醋酸铅（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、甲醇（色谱纯，菲律宾DIMA 公司），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 实验方法

2.1 龙胆病害防治和采样

试验在哈尔滨松北区万宝药材种植基地进行。根据室内药效筛选结果，选出田间药剂试验农药嘧霉胺。8月上旬开始对二年生粗糙龙胆用药防治龙胆病害，以嘧霉胺800倍液喷雾防治，每隔7-10天施药一次，共施药8次，于最后一次（9月24日）用药后第二天开始采样，依次经过1、3、5、7、14、21天采集样品。

2.2 农药残留测定方法考查

2.2.1 色谱条件

C18ODS Hypersial column色 谱 柱 （125 mm×4.0 mm），流动相为甲醇-水溶液（V：V =75: 25）；流速1 mL·min-1；检测波长270 nm，柱温20 ℃；进样量20 μL。

2.2.2 样品制备方法考查

方法一：精密称取20.00 g龙胆样品，匀浆，加80 mL甲醇，超声30 min，抽滤，用80 mL甲醇冲洗滤渣数次，抽干，合并滤液。将滤液在45℃下浓缩至50 mL，加180 mL蒸馏水、20 mL饱和醋酸铅、45 mL饱和氯化钠，摇匀，静置数分钟。抽滤漏斗加石英砂抽滤，再用二氯甲烷冲洗滤渣并抽干。取滤液，加100 mL二氯甲烷萃取。取二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液在60℃水浴中减压浓缩至干，甲醇定容至2 mL，过0.45 μm滤膜备用。

方法二：精密称取20.00 g龙胆样品，加乙腈50 mL，匀浆，抽滤。滤液置分液漏斗中，加饱和氯化钠50 mL进行萃取，取乙腈相，用50、25、25 mL二氯甲烷对水相分3次萃取，合并二氯甲烷和乙腈相加无水硫酸钠抽滤，45℃下减压浓缩至干，用2 mL甲醇润洗残渣并定容，过0.45 μm滤膜备用。

表1 样品制备方法考察

方法三：精密称取20.00 g龙胆样品，匀浆，加丙酮100 mL，超声10 min，滤过，残渣加50 mL丙酮，超声提取10 min，滤过，合并滤液，在不高于40℃条件下减压浓缩，控制浓缩液体积至30 mL左右。取100 mL 10 %NaCl溶液注入分液漏斗中，再注入上述浓缩液，取100 mL正己烷对上述回收瓶分次洗涤，将洗液也注入同一分液漏斗中，摇匀5 min，静置分层，将正己烷层移入300 mL锥形瓶中，水层加50 mL正己烷，摇匀5 min，静置分层，将正己烷层移入上述锥形瓶中，加10 g无水硫酸钠，静置15 min，滤过。用20 mL正己烷洗涤锥形瓶及滤纸上残留物，重复两次，滤过，合并滤液，45℃下减压浓缩至干，残留物加1 mL甲醇溶解，定容于1 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜备用。

方法四：将100.00 g龙胆用匀浆机打碎，置于烧杯中，加150 mL丙酮，超声10 min，抽滤，取滤纸上的残渣加75 mL丙酮，超声10 min，按上述同样操作合并滤液，用25 mL丙酮分次冲洗烧杯然后冲洗滤渣，40℃下减压浓缩至约60 mL浓缩液，取100 mL 10 % NaCl溶液移入分液漏斗中，再注入上述浓缩液，取200 mL正己烷对上述回收瓶分次洗涤，将洗液也注入上述分液漏斗中，摇匀5 min，静置。把正己烷层转移至300 mL锥形瓶中，用100 mL正己烷对水层按上述操作再萃取，正己烷层也移入上述锥形瓶中，加入20 g无水硫酸钠，反复振荡数次，静置15 min，过滤，滤液置于回收瓶中，取20 mL正己烷洗涤三角瓶及滤纸上的残留物，重复操作两次，两次滤液合并，移于回收瓶中，40℃下减压浓缩至干。残留物加1 mL甲醇溶解并定容于1 mL容量瓶中，溶液用离心机在2 000 r·min-1离心2 min，过0.45 μm滤膜备用。

根据4种样品制备方法（以9月25日样品为例），见表1。结果表明，方法三、方法四可检出嘧霉胺，方法四较方法三嘧霉胺的富集量明显增大，方法一、方法二在上述色谱条件下均无峰。

2.2.3 流动相考查

比较了不同甲醇-水的比例下吸收峰的保留时间和面积，结果见表2，表明流动相的比例为甲醇：水=60:40为最佳比例。

2.2.4 标准曲线的制备

精密称取1.18 mg的嘧霉胺标准品于1 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成1.18 mg·mL-1的标准溶液，从中依次精确吸取500、250、125、62.5 μL定容至1mL容量瓶中，分别配制成1.18、0.59、0.29、0.15、0.07 mg·mL-1。按流动相为甲醇-水溶液（V:V =60: 40）；流速1 mL·min-1；柱温20℃；检测波长270 nm；进样量20 μL。分别测定上述样品，每份样品平行3次，并且记录色谱数据，绘制标准曲线。

表2 流动相比例的考察结果

以峰面积（Y）对浓度（X）建立回归方程Y = 42 564 X + 593.02，（R2= 0.999 9，n=5）。结果表明嘧霉胺在1.16-0.07 mg·mL-1的浓度范围内呈现良好的线性关系。稀释嘧霉胺对照品溶液至记录到嘧霉胺响应的信噪比S/N=3为最低检测限。结果表明，嘧霉胺的最低检测限为0.018 mg·mL-1。结果见图1，图2。

2.2.5 精密度试验

取同一样品溶液20 μL进样，重复5次，检测精密度。结果显示，RSD=1.71 %，表明精密度良好。

2.2.6 稳定性实验

取样品溶液20 μL，每隔2 h进样一次，依次测定6次，考查其稳定性。结果显示，RSD=1.83 %，表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.7 重现性试验

取龙胆样品100 g，共5份，按优化的样品制备方法制备样品，并进行含量测定，每份重复5次。结果显示，含量平均值为1.21 mg·kg-1，RSD=1.55 %，表明重现性良好。

2.2.8 加样回收实验

取同一批龙胆样品100 g，共3份，分别加入0.126、0.05、0.02 mg标准品后，按优化的方法提取测定（表3）。结果显示，3种不同加样量平均回收率分别为96.2%、95%、99.9%，RSD为1.80%、1.35%、1.22%，表明回收率良好。

2.3 嘧霉胺残留量测定及消解动态图的绘制

根据上述实验结果选择适宜样品制备方法及分析方法进行测定，建立消解动态方程。

3 实验结果

通过方法四，并且在甲醇：水（60:40）条件下进行色谱分析，测出9月25日至10月15日样品中嘧霉胺的含量，并绘出消解动态图，建立消解方程。

图1 标准曲线洗脱曲线

图2 龙胆中嘧霉胺的色谱图注：a. 样品（tR=9.122），b. 标准品。

结果见表4和图3，表明嘧霉胺在用药后第一天残留量（C）最高达到1.456 0 mg·kg-1，在用药后从第3天开始迅速下降，从第6天开始缓慢下降。经Curveexpert 1.3拟合，得消解动态方程 C=1.456 9-0.910 5 exp（59.2146 t-2.7442），相 关系数（Coefficient Data）r=0.999 3，标准差（Standard Error）为0.023 9，半衰期为6.65天。

表3 加样回收实验

表4 龙胆中嘧霉胺残留量测定结果

图3 龙胆中嘧霉胺的消解动态

4 讨论

龙胆（粗糙龙胆）较东北龙胆长势强，植株高，叶茂盛，根系发达产量高，是主要栽培种，但病害较重[8]。在龙胆草栽培过程中发生多种病害，主要有龙胆斑枯病和叶枯病，造成的损失大[9]。使用常用药剂不能有效控制这些病害[10]。

对龙胆的斑枯病防治应采用综合防治措施，用化学药剂防治仍是最有效的措施[5,11]，常用农药有甲基托布津、代森锰锌、杀毒矾等。由于使用时间长都产生了一定抗药性。而嘧霉胺是应用于龙胆的斑枯病和叶枯病防治新型农药，效果很好。嘧霉胺是近年来开发的一种结构新颖、有独特作用机制的新型杀菌剂，是农业部推荐的绿色农业优先使用的农药。嘧霉胺能被植物叶及根吸收，在农业上对葡萄、草莓、观赏植物等的灰霉病有很好的防治效果。中国对嘧霉胺在农产品中的最高残留限量尚无标准，国内外对嘧霉胺残留量分析采用液相色谱法[12]、气相色谱法（NPD检测器）[14]及气（液）质联用等方法，其中液相色谱法操作简便，分离效果好、精密度高是常用方法。

本文首次以高效液相法研究了嘧霉胺在龙胆草中残留和消解规律，建立了嘧霉胺在龙胆草中的高效液相检测分析方法；对样品制备条件、流动相组成进行了优化；研究了龙胆草中嘧霉胺的消解动态，以数学模型描述了嘧霉胺的降解规律。农药残留分析中样品处理是最难的，因为不同材料中所含杂质成分不同、种类多且与农药成分很难分离，针对特定分析材料筛选出有效农药富集方法及分析方法成为研究的难点，实验筛选了龙胆中嘧霉胺的富集方法，表明用丙酮提取，正己烷萃取为最佳方法，相比用二氯甲烷萃取，更安全；方法四较方法三只是增加了处理样品量，但富集效果却明显好，可能是由于农药在药材中残留量很少，增加处理样品量可以减少富集过程中实验误差，从色谱峰图可以看出，虽然杂峰较多，但是嘧霉胺峰与其它峰的分离度大于1.5，流动相选择甲醇：水（60:40）为最佳条件。此方法精密度高、重现性好，回收率高，嘧霉胺的最低检测限达到0.018 mg·mL-1，因此完全可以用来测定龙胆中嘧霉胺的残留量。

本研究建立的嘧霉胺消解方程是经运算优选的，其相关系数为0.999 3，标准差为0.023 9，说明方程精度高，拟合好，能准确描述嘧霉胺在龙胆中的消解规律，也可以根据用药后时间预测龙胆中嘧霉胺残留量，从消解规律来看，末次喷洒嘧霉胺第1天和第3天后含量没有明显减少，但从第3天开始明显下降，从第15天开始，消解速度又变得非常缓慢，含量下降大约至第1天的1/3。从消解动态来看，嘧霉胺残留量最终高于美国环保总署制定的香蕉中嘧霉胺残留限量MRL（0.1 mg·kg-1），为了减少龙胆药材中农药残留，建议通过减少使用次数与其它农药交替使用。由于栽培龙胆一般是种植3年采收，栽培第1-2年可以多用，第3年少用或不用，距离收获的安全间隔期要大于15天，这不仅能有效防治斑枯病、叶枯病等，而且能使得嘧霉胺的残留降到安全限度，提高药材质量和保证用药安全。本文对中药材生产过程的农药残留规律进行了探讨，对指导中药材规范化生产及促进中药现代化具有现实的意义，也为其它中药材农药残留研究提供借鉴。

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Study on Residue Trends of Pesticides Pyrimethanil in Gentian

Mu Jinjiang1,Sun Haifeng2,Zhang Shuainan2
(1.The Second Affiliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150086 ,China; 2. Pharmaceutical College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

The study aimed to establish asuitable method for analyzing pyrimethanil in gentian,in order toexplore the residue trends of pyrimethanil in gentian and its degradation dynamics. The high performance liquid chromatography (HPLC) method was the first to be performed in this study tolearn the residue trends of pyrimethanil. Prior to sampling gentian at different time intervals,the samples were spreaded by pesticides for eight times at the same timeline. The preparation method and chromatographic conditions were optimized and analyzed. As a result,the HPLC method that detected the residues of pyrimethanil in gentian was established. The content of pyrimethanil in the gentian samples degradated over time,and its resolution equation was C=1.4569-0.9105exp(59.2146t-2.7442) with the half-time of 6.65 days. It was concluded that HPLC method for determining the pyrimethanil residues of gentian was reliable,and the resolution equation accurately described the principle of pyrimethanil degradation in gentian. By reducing the frequency and alternating theutilization of pesticide,prolonging the security intervals of harvesting may reduce the pesticide residues.

Pyrimethanil,HPLC,gentian,pesticide residue

10.11842/wst.2016.05.030

R282.2

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-01-28

修回日期：2016-02-13

＊ 科学技术部国家“十一五”支撑计划项目子课题（2006BAI09B04-10）: 种子贮存、栽培生产、商品流通等环节的病虫害防治技术研究-龙胆的关键病害防治技术研究，负责人：孙海峰。

＊＊ 通讯作者：孙海峰，博士，教授，主要研究方向：中药资源与开发研究。