肉制品掺假鉴别技术研究进展

董洋洋，丛树阁，俞龙浩

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319；2.大庆质量技术监督局）

肉制品掺假鉴别技术研究进展

董洋洋1，丛树阁2，俞龙浩1

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319；2.大庆质量技术监督局）

近年来，食品安全问题日益突出，其中肉制品掺假现象十分严重，成为人们日益关注的焦点，使肉类掺假鉴别技术得到了快速发展。对基于蛋白质、DNA和光谱无损检测的肉制品掺假鉴别技术进行了概述，并对肉制品鉴别技术的发展趋势进行了探讨，期望为食品安全监测提供理论参考。

肉制品；掺假鉴别；定量检测

随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，人们对肉制品的需求量越来越大。我国是人口大国，对肉制品的消耗量更是逐年升高，这使得许多不法商贩趁机以低价肉代替高价肉，牟取暴利。

近几年，在欧洲用廉价肉代替高价值的肉是肉制品行业中常见的欺诈行为。在2013年，欧洲曾被卷入肉类掺假的丑闻，在生牛肉食品中含有未声明的马肉成分［1］，这使得许多食品公司不得不撤回这些假冒产品。虽然食用马肉不会对食品安全产生直接的影响，但是这揭示了食品供应链可追溯性存在的问题。简单的肉类替代现象的发生是由于它们的形态和质地相似，并且存在巨额利润的潜力，这就暴露了行业上广泛用低质量的廉价肉替代高质量肉类的掺假行为［2］。

随着时代的改变和健康、宗教等原因［3-4］，消费者喜欢新鲜、优质、安全的食品［5］，对由于错贴标签使高商业价值的肉制品被低价值的肉类替代［6］造成的健康、宗教和经济问题的关注正在增加［7］。穆斯林人和犹太人受宗教信仰的影响，认为吃猪肉和马肉是有罪的，即使微量也是不可接受的［8］。肉类掺假现象的出现，给消费者带来了食品安全、经济损失和宗教信仰方面的担忧和恐慌。因此，通过物种鉴定对肉类成分进行常规检测在未来的研究中将更加重要。

目前，基于蛋白质的方法［9-10］、DNA的方法［11-16］和脂肪的方法［17-18］已经大量用于肉制品掺假鉴别中。蛋白质分析法能够对肉制品进行定性定量检测，但不适用于蛋白质变性的产品；基于DNA的方法是目前最为成熟的方法，准确性高，但是操作较为复杂；光谱检测法操作简单且对样品无损坏，具有良好的应用前景。

1 基于蛋白质的检测方法

肉制品的主要成分是蛋白质，不同物种的蛋白质具有一定的特异性，因此通过分析蛋白质可以鉴别不同物种。常用的检测技术包括电泳分析法、色谱分析法和免疫分析法。

1.1 电泳分析法

电泳分析法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、同工酶染色法和毛细管电泳法［19］。聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够分离不同物种肉制品中蛋白质的特征图谱，但该方法重现性差。等电聚焦法主要是利用不同蛋白质等电点的差异进行蛋白质的分离，该法得到的蛋白质图谱比较复杂，不适用于混合肉样品的鉴定。同工酶染色法对催化过程的酶活性要求较高，因此不适合于加工肉制品和未知肉类样品的鉴定。毛细管电泳法也不适用于混合肉样品，且检测仪器成本较高［20］。

肉制品中蛋白质会受到很多因素的影响，使同一物种间也会产生一定的差异，且加工食品中蛋白质发生了变性，只有对热稳定的蛋白质才能用于检测，使得检测具有一定的局限性。因此，肉制品蛋白质分析方法使用时通常与其他方法结合使用。

1.2 色谱分析法

高效液相色谱法（HPLC）灵敏度高、速度快、应用范围广，是色谱分析法中应用最广泛的方法。在肉制品分离、鉴别中也有许多应用。Giuseppe AMAD等［21］建立了一个仅用7 min就能快速对生牛肉样品中马肉肌红蛋白进行分离和量化的方法，检测限为0.1%（W/W），有较高的再现性和灵敏度。但对于加工的肉制品，由于蛋白质发生了不可逆变性，色谱法不能很好的检测。且由于谱图复杂、仪器昂贵，色谱法不适用于实验室常规检测。

1.3 免疫分析法

免疫分析法主要包括试管沉淀法、琼脂扩散法、对流免疫电泳法、放射免疫法、免疫组化法和酶联免疫分析法，其中应用最广泛的是酶联免疫分析法（ELISA）。

骆训国等［22］采用抗猪IgG-Fc单克隆抗体作为捕获抗体，以猪IgG作为检测标志物，建立了检测猪肉成分的夹心酶联免疫分析法（sELISA）。检验生肉样品灵敏性高，最低能检测到1%的掺杂量；该方法特异性好，只与猪肉发生反应，而与牛肉、羊肉、鸡肉和兔肉等均不发生反应，且重复性好、操作方便、快捷，样品需要量少，设备廉价。

Chen等［23］采用sELISA的方法，使用一个36 kDa热稳定的鱼肌肉蛋白质的多克隆抗体，在100℃时8 min就能够检测全部63种常见的生、熟鱼样本，而测试与非鱼样品没有任何交叉反应。该法还可以检测出不同加工程度的鱼类产品，对在蟹肉中的生鱼和熟鱼（鳕鱼、鳕鱼和巴沙鱼）的检测限为0.1 ppm。实验结果显示，细胞内（CV≤8.9%）和细胞间变异（CV≤9.3%）性低。假阳性和假阴性率都为0%。该方法是一种有效的对食品中的鱼肌肉蛋白质检测方法。

ELISA方法灵敏度好，但其局限性在于如果目标蛋白在食品加工中发生变性，抗原表位可能在抗体检测中检测不到，所以只有找到对热稳定的蛋白质才能很好的进行检测［24］。

2 基于DNA的检测方法

基于蛋白质的方法在早期的肉制品检测中起到了十分重要的作用，但由于其重复性差、灵敏度低、耗时长等不足，在检测中仅作为辅助方法进行使用。目前，基于DNA的多种PCR方法是对肉制品进行鉴别的较为成熟的方法。常用的基于DNA的检测方法有多重PCR、PCR-RFLP、RAPD-PCR、荧光定量PCR和物种特异性PCR等。

2.1 多重PCR检测法

多重PCR是对多个物种分别设计特异性引物，在一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增。该方法成本低、高效、省时，可对多种成分同时进行鉴别。

Iwobi等［25］报告了三重实时PCR方法对肉馅产品的定量检测。该方法采用特异性识别牛和猪源性成分的探针序列，对牛肉和猪肉组分进行定量。三重PCR检测方法的检测限为20个基因组当量，此时测量的不确定性为1.83%。该方法对几种市售肉馅产品进行了验证，重现性和稳定性方面表现良好。

Kitpipit等［26］第一次成功运用了直接多重PCR的方法，该方法无需预先提取DNA，可以直接进行PCR-DNA的扩增，同时又对这种快速、经济且能同时鉴别六种普通消费肉制品种类的方法进行全面的验证。为了实现这些，从先前的报道和新设计的来自细胞色素b基因、COI和12s rRNA的基因中选择出来了六个物种的特异性引物，该分析得到了猪肉、羊肉、鸡肉、驼鸟肉、马肉和牛肉的PCR产物，分别是100、19、113、15、253和311 bp的片段。验证结果分析显示该方法快速、经济、可再生，且特异性高，可以应用到许多生肉及其产品中，包括高度处理的食品样品。这个方法对消费者、食品工业和法律执行部门来说是很有益的。

但多对引物在同一体系中发生反应，需要设计好反应条件，摸索引物之间的相互作用，建立理想的反应体系才能得到预期的效果。且因非特异性扩增会产生假阳性结果，对于未知基因序列的物种，也难以应用PCR技术进行鉴定。

2.2 PCR-RFLP检测法

限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCRRFLP）是用PCR扩增目的基因，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小的片段，直接在凝胶电泳上分辨并获得图谱。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，会产生不同长度的DNA片段条带。

Chen等［27］应用PCR-RFLP分析和实验室achip系统结合的方法鉴定台湾海峡的62种经济鱼类，将线粒体细胞色素b基因的464 bp长度的片段通过PCR扩增。结果表明，该实验提供了一个快速、方便、自动化、可靠的分析方法，这种方法是费用低、操作简单、实验程序较少，能够解决乱贴标签、欺诈行为和替换情况的发生，在食品进出口快速检测中将发挥重要作用。

Girish PS等［28］以线粒体12S rDNA为目的基因，利用PCR-RFLP检测法鉴定牛肉、水牛肉、羊肉和山羊肉。用PCR扩增这些物质456 bp的片段，用Alu I、Hha I、Apo I和BspT I 4种限制性内切酶催化分解扩增的片段，产生的片断可以鉴定这四种肉类。

该方法检测成本低、易操作、分型时间短，已广泛应用于肉制品鉴别。但容易受到目标基因序列中酶切位点随机突变的影响，易产生不确定性的检测结果。

2.3 RAPD-PCR检测法

随机扩增多态性聚合酶链式反应（RAPDPCR）是在一个能识别多个肉类物种的快速、简便的鉴别方法，将它产生的特异性指纹图谱与已知图谱进行比较即可确定肉类物种。避免DNA复制、测序或杂交等复杂的分析步骤。Saez等［29］采用RAPDPCR方法鉴别牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和火鸡肉，PCR过程先用一个寡核苷酸引物对样品中的DNA序列进行随机扩增，将扩增产物的电泳指纹图谱与已知样品进行比对来确定样品所属的种类。RAPD-PCR模式的快速、简单使得这种技术适合肉类认证的常规分析。Rastogi等［30］应用RAPD-PCR技术鉴别蛇肉和水牛肉，研究结果显示，对于物种鉴定和身份验证来说，线粒体标记比核标记更有效。RAPD-PCR方法鉴别能力几乎是无限的，因为它的引物始终随机的，无需专门设计引物。

RAPD-PCR方法具有准确、简单、快速、高效的特点。但该方法属于非特异性的反应，因此只适用于单一样品的检测，随机扩增的重现性差，易受到食品中其他DNA成分的严重干扰，扩增反应条件微小变化都可能导致结果的偏离。

2.4 物种特异性PCR检测法

物种特异性PCR方法是针对不同物种的差异性序列设计引物的，从而实现从复杂基质中较为灵敏地将目的片段进行扩增并进行成分鉴别的目的。该方法无需对产物进行测序或进行限制性片段长度多态性分析（RFLP）。Amaral等［31］采用物种种特异性PCR方法对18种野味商业香肠进行检测，18个商业样品的评价结果确定了几个与标签不一致的地方，即在10个样品中有未声明的野味种类（红鹿、野兔和兔），并在9个分析样品中有未申报的奶牛肉存在。该方法特异性高和灵敏度好，对兔肉和牛肉检测的相对水平达到0.01%，对红鹿肉和猪肉为0.1%。Amaral等［32］还采用物种特异性PCR方法鉴定鸭肉、鹧鸪肉、野鸡肉、鹌鹑肉、鸡肉和火鸡肉，最终对传统野味Alheira香肠的真实性进行了评估，结果显示了高度特异性和灵敏度，检测限下降到0.01%的水平（W/W）。PCR显示的结果与产品标记信息存在一些不一致的地方，即产品中缺少标签中声明的野生种类（鸭、鹌鹑和野鸡），且存在未声明的国内禽肉种类。Karabasanavar等［33］采用高度特异性PCR检测方法，通过使用猪新设计引物线粒体D-loop基因检测猪肉掺假，得到了一个712 bp的独特扩增子，通过测试排除其与24种动物产生交叉扩增的可能性。结果表明，在生、熟、高压灭菌的和微型烤箱加工的猪肉中，PCR检测均是适宜的，该方法的灵敏度是0.1%，猪DNA的检测限（LOD）为10 pg。

物种特异性PCR方法特异性强、灵敏度高，不仅适用于单一成分的检测，也适合于混合样品的检测，尤其适用于经过加工的肉制品。

2.5 荧光定量PCR检测法

荧光定量PCR在扩增的早期即可以定量，省去了费时费力的测序、酶切、构象分析步骤，直接采集荧光信号，省去电泳的麻烦，反应快速、可实现高通量，封闭体系避免污染等特点使其相比于普通PCR具有更大的优势。目前，我国已颁布的动物源性成分鉴别国家标准和行业标准主要采用的是普通PCR和荧光定量PCR技术，并已经形成了成熟的方法体系。Druml等［34］提供了一种单一的荧光定量PCR检测技术测定肉类产品中掺假鹿肉的含量。该PCR方法与野生肉制品中可能含有的20种动物源成分和43种植物源成分没有交叉反应。定量检出限为黇鹿肉和马鹿肉为0.5%，梅花鹿肉为0.1%。在一般情况下，鹿肉含量测定与实际鹿肉含量偏离不大，系统误差低于25%，相对标准偏差通常低于10%，表明此测定方法在重复性和精确性上表现良好。Cheng等［35］开发了一种准确、可靠的多重TaqMan荧光定量PCR方法鉴定和量化中国血豆腐产品中鸭肉，鸡肉和猪肉的DNA含量。该试验对靶DNA的检测限为0.15 ng，并且每个物种分析的的灵敏度都为1%。该方法能同时鉴定这三种物种，与传统方法相比，达到了更高的灵敏度。因此，这种测定方法可广泛用于血豆腐中其他动物源性成分的鉴别，这将有利于在质量控制和食品供应方面的安全保证。Soares等［36］提出了一种荧光定量PCR方法检测和定量肉制品中的大豆成分，结果证明特定的TaqMan探针是一种强大的工具，而且具有高特异性、高灵敏度和高准确性的特点，能检测0.01%～6%干基线性动态范围的大豆蛋白。该方法通过在盲目混合物分析中得到的低标准误差和高重复性证明内部验证已经成功。

荧光定量PCR检测虽然比常规PCR使用的特异性引物和探针昂贵［37-39］，但可对掺假百分含量进行定量，为掺假鉴别提供依据。

2.6 基于DNA检测的其他方法

2.6.1 四聚PCR检测法

Safdar等［40］开发了一种四聚PCR检测法，用于快速、可靠地同时鉴定香肠中马肉，大豆，家禽肉和猪肉物种的成分。该方法合并使用马肉、大豆、家禽肉以及猪肉的线粒体细胞色素b、外源凝集素、12S rRNA和ATP酶亚基的扩增小片段，从对照组香肠分离出良好品质的DNA用于优化分析。对照组香肠样品的四聚分析表明，该测定的每一个物种的检测限均为0.01%。所有的数据都显示，该四聚PCR方法对商业香肠中马肉、大豆、家禽肉和猪肉成分的检测是一种简单、快速、灵敏、特异且经济的检测方法。

四聚PCR测定法可以更容易地使用物种特异性引物，对香肠的成分进行鉴别。此外，四聚PCR检测的高灵敏度、特异性和再现性表明，这种方法是可行并且理想的方法，可以快速分析商业香肠样品来识别肉品掺假和避免疾病的风险。

2.6.2 微滴式数字PCR检测法

Floren等［41］描述了一种微滴式数字PCR（ddPCR）测定靶向核F2基因，对牛肉、马肉和猪肉在加工肉制品中精确量化的方法。运用该方法对14个不同的物种进行了特异性验证，结果显示定量限（LOQ）和检测限（LOD）分别为0.01%和0.001%。因此，用ddPCR法测定食品中F2基因，可以推荐给生产体系中的质量保证和控制系统使用。

3 基于光谱的无损检测方法

近年来，光谱技术被广泛应用到食品检测中，在肉制品检测中的优势也日益凸显，光谱技术具有快速、无损、无需复杂的样品前处理等优势，可以进行在线无损检测，是一种有前景的肉制品无损检测方法。

3.1 红外光谱法

传统的化学检测一般通过化学分析、仪器分析、感官评定、筛选分析等损坏性检测手段来完成，不能满足大批量快速、无损检测的需求。近红外光谱分析技术作为一种绿色分析技术，具有客观、快速、无损、精确、多指标、可再现、易操作、经济等优点。目前，红外光谱（FTIR）分析技术在肉类鉴别中应用广泛［42］。

Zhao等［43］采用衰减全反射中红外光谱和多因素数据分析进行模型建立，对使用内脏掺假的新鲜和冷冻牛肉汉堡产品进行检测和鉴别，检测结果显示灵敏度保持在1.0，特异性范围为0.29～0.91。对没有掺假的样品检出率为100%。Rohman等［44］采用FTIR和化学计量学结合的方法来区分和量化鱼肝油中的羊肉脂肪，在频率范围3 010～2 995 cm-1和500～900 cm-1内，用FTIR和化学计量学相结合方法可以鉴别出鱼肝油中是否掺有羊肉脂肪，准确性可达100%。该方法快速、无损、检测时间短、检测准确度高，在肉类鉴别中应用较为广泛。

3.2 拉曼光谱检测法

在最近十年，傅立叶变换红外光谱和拉曼光谱已经在肉制品鉴别中开始使用［45］。拉曼光谱的优点是提供关于分子的化学结构信息，而不会对样品造成任何的改变和破坏［46］，样本需要量少［47］，并且检测快速［48］。与此同时，拉曼光谱具有高效的特点，可在加工和储存过程中评价食品质量［49］。拉曼光谱与化学计量学数据分析方法的结合，使研究人员能够以更快速的方式确定食物是否掺假［50-51］。

Zajac等［52］提出了一种FT-拉曼测量的新方法，确定在牛肉混合样品中马肉的含量。结果显示光谱参数与所研究的样品的化学成分之间的有良好拟合性。所提出的方法具有许多优于其他技术的优点，如检测速度快并且可以直接用于分析鲜肉混合物。Boyac等［53］利用拉曼光谱结合主成分分析的方法，很好的检测了在牛肉中掺假0%、25%、50%、75%和100%（重量）的马肉样品，完成了牛肉和马肉样品的区分。该方法精度高、检测时间短、不需要耗费大量时间去准备样本，这种方法对于肉类掺假鉴别是一个有前途的技术。

3.3 TD-NMR检测法

在过去的十年中，低分辨率核磁共振氢谱（HRNMR）和时域核磁共振氢谱（TD-NMR）已经作为替代传统方法较完美的技术，它快速、简便并且对于在线现场检测有很大的潜力［54-55］，但与HR-NMR相比，TD-NMR运用了永磁铁技术，显著地减少整个系统的运行成本。

CPMG自旋回波序列，常用于检测横向弛豫时间T2的脉冲序列，也常用于代谢组学研究检测小分子氢谱。Pereira和Colnago［56］已经应用CPMG衰变结合偏最小二乘分析和PCR方法去预测牛肉样品的水分含量。结果非常可观，相关性系数较高，校准误差较低。Santos等［57］使用TD-NMR的方法快速、无损地鉴别牛肉样本的性别和种族，采用单变量和多变量分析处理。结果表明，当TD-NMR光谱与单变量和多变量分析结合时，用于追溯牛肉样品性别和种族的结果十分准确。该方法提供了一个快速、廉价、无损、可靠的识别技术，即使在包装成品中也可用于检测。TD-NMR的检测方法简单、快速、无损，是一个有前景的鉴别肉制品的方法。

4 结论

随着科学技术的进步，肉制品掺假鉴别技术得到了迅速的发展。目前，基于蛋白质的检测方法受到蛋白质变性、仪器昂贵、操作复杂等诸多因素的限制，未得到广泛应用。基于DNA的检测方法对肉制品的掺假鉴别技术较为成熟，特异性强、灵敏度高，虽然操作过程较为复杂，但仍是目前最权威的鉴别方法，其中，荧光定量PCR还可对掺假百分含量进行定量，为掺假鉴别提供数据支持。光谱技术是一种快速、无损的检测技术，且检测不需要样品的前处理，是一种前景光明的检测技术。但目前该方法不如荧光定量PCR方法的准确度高，不能很好地判断肉制品是无意污染还是恶意掺假，只能为鉴别肉品掺假提供一定的参考。

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Research Progress of Identification Techniques of Meat Products Adulteration

Dong Yangyang1，Cong Shuge2，Yu Longhao1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Quality and Technology Supervision Bureau of Daqing）

In recent years，food safety issues had become more and more serious，among which the meat adulteration became the focus.So meat adulteration identification technique has developed rapidly.Detecting technique of meat adulteration such as Proteinbased，DNA-based and spectral-based technique was reviewed，and development trend of these methods was discussed to provide a theoretical reference for food safety monitoring.

meat；adulteration identification；quantitative detection

TS251

A

1002-2090（2016）03-0071-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.015

2015-04-23

董洋洋（1990-），女，黑龙江八一农垦大学食品学院2014级硕士研究生。

俞龙浩，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：yu2058@sohu.com。