犬肠道冠状病毒基因型和重组的研究进展

王欣宇，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）

犬肠道冠状病毒基因型和重组的研究进展

王欣宇，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）

犬肠道冠状病毒（CCoV）与猪传染性胃肠炎病毒、猫冠状病毒同属于冠状病毒科、冠状病毒属、α-冠状病毒-1成员。CCoV感染一般引起幼龄犬发生非致死性的轻度腹泻，呈现高发病率、低死亡率的特点，当与其他肠道病原混合感染时，能导致患病动物高的死亡率。近年来，随着CCoV高致病性的变异毒株在欧洲国家陆续报道，该病再一次引起了广泛的关注。为了增加对CCoV近年来遗传进化的了解，对CCoV基因型和重组研究进展做了综述，为CCoV的深入研究提供参考。

犬冠状病毒；基因型；重组变异

犬肠道冠状病（Canine coronavirus，CCoV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）、α-冠状病毒-1种（Alphacoronavirus-1）成员，是单股、正链、有囊膜的RNA病毒［1］。CCoV基因组长为27～32 kb，编码纤突糖蛋白（Spike protein，S）、膜蛋白（Membrane protein，M）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N）和小膜蛋白（small envelope protein，E）。其中，CCoV S蛋白是位于病毒粒子表面的囊膜糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞以及介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用。自1971年首次在德国报道后，CCoV在亚洲、欧洲、南美洲、北美洲等多个国家和地区相继被报道，呈现世界范围内流行，给养犬业带来严重危害［2］。在我国，徐汉坤等［3］在犬传染性肠炎中首次报道了CCoV感染。此后，我国研究者对CCoV流行病学、病毒分离与鉴定、诊断方法、基因工程疫苗等方面展开了广泛而深入的研究［4-6］。Buonavoglia等［7］，在意大利，报道一个CCoV-II高致病性的变异毒株（CB/05毒株），能够导致犬高的致死率。高致病性CCoV毒株出现后，国内外研究者对CCoV遗传演化、致病性和重组展开了广泛的研究，积累了大量有价值的信息，增加了对CCoV的理解。根据目前研究成果，仅对CCoV基因型和重组研究进展做一综述，为CCoV相关研究提供参考。

1 CCoV基因分型及地理分布

Binn等（1971）首次在德国军犬中成功分离出CCoV后，CCoV的遗传演化得到了广泛而深入的研究［2］。Pratelli等［8］报道，在意大利腹泻幼犬中，一些CCoV毒株M基因出现点突变，这些非典型的CCoV毒株被命名为猫冠状病毒类似的CCoV毒株（FCoV-like CCoVs）。CCoV毒株ORF1a、ORF1b和ORF5序列分析发现，在CCoV阳性的犬腹泻样品中，存在着2个不同的CCoV遗传进化群，一个遗传进化群由Insavc-1、K378等CCoV经典毒株组成，而另外一个遗传进化群由FCoV-like CCoV毒株组成［9］。Pratelli等［10］测定了一个FCoV-like CCoV毒株（Elmo/02）S基因80%的核苷酸序列，进化性分析表明，Elmo/02毒株与猫冠状病毒I毒株（FCoV-I）表现出显著的遗传相似性（～81%氨基酸相似性），但是在进化树中与CCoV经典毒株、FCoV-I型毒株和猫冠状病毒II型毒株（FCoV-II）处于不同的进化群中。根据这个结果，Elmo/02毒株被指定为CCoV-I型毒株，而CCoV参考毒株被称为CCoV-II型毒株。与CCoV-II型毒株相比，CCoV-I型毒株（Elmo/02）在S基因下游含有一个完整的开放阅读框3（ORF3），编码一个未知功能的糖蛋白。根据CCoV S蛋白N端结构域（NTD，aa 1～300）氨基酸序列，CCoV-II型毒株被分为CCoV-IIa亚型和CCoV-IIb亚型。目前，CCoV-IIa和CCoV-IIb分类在病毒学分类中没有被接受，但是在文献报告中被广泛应用［11］。目前，根据M基因序列，能鉴别CCoV-I型毒株和CCoV-II型毒株；根据S基因部分序列，能鉴别CCoV-I、CCoV-IIa和CCoV-IIb型毒株［12］。

目前，研究者对不同CCoV基因型毒株在部分国家犬中感染情况进行了调查研究。在欧洲，Decaro等对1172份来自于2001～2008年期间犬腹泻粪便样品中CCoV进行了调查，CCoV阳性率为42.06%（493/1172），其中CCoV-I为7.94%（93/1172），CCoV-II为18.6%（218/1172），CCoV-I+II为15.53%（182/1172），CCoV-IIb为6.66%（78/1172）［13］。在西欧地区，Decaro等［14］报道，CCoV在犬腹泻样品中的阳性率为38.46%（60/156），其中意大利为51.28%（20/39，CCoV-I（1），CCoV-II（10），CCoV-I+II（9）），比利时为80%（8/10，CCoV-I（2），CCoV-II（6）），荷兰为60%（3/ 5，CCoV-I（1），CCoV-I+II（2）），德国为38.09%（8/21，CCoV-II（7），CCoV-I+II（1）），英国为12.5%（1/8，CCoV-II（1）），西班牙为36.17%（17/47，CCoV-II（10），CCoV-I+II（7）），法国为11.54%（3/26，CCoV-II（2），CCoV-I+II（1））；在60个CCoV阳性样品中，CCoV-I为40%（24/60），CCoV-II为93.33%（56/60），CCoV-I和CCoV-II共感染为33.33%（20/60）。在阿尔巴尼亚，Cavalli等［15］报道，CCoV在犬腹泻粪便样品中阳性率为53.39%（31/57），其中CCoV-I阳性率为33.33%（19/57），CCoV-II阳性率为45.61%（26/57）；26个CCoV-II毒株亚型分析显示，23个毒株属于CCoV-IIa型，3个毒株属于CCoV-IIb型［15］。在希腊，Ntafis等［16］报道，CCoV在腹泻犬粪便样品中阳性率为65.1%，其中47%阳性样品存在CCoV一个以上型和亚型的共感染，包括CCoV-I/CCoV-IIa/CCoV-IIb共感染。

在中国，Wang等［17］报道，CCoV-II在健康犬和腹泻犬粪便中的阳性率分别为86.42%（70/81）和43.75%（21/48）；在健康狐狸粪便中，CCoV-I阳性率为47.54%（29/61），CCoV-II阳性率为70.49%（43/61），CCoV-I和CCoV-II共感染率为40.98%（25/61）；在貉粪便样品中，CCoV-II阳性率为91.67%（22/24）。Wang等［18］报道，CCoV在黑龙江地区犬腹泻粪便中的阳性率为28.36%（57/201），其中CCoV-I占15.79%（9/57），CCoV-II占84.21%（48/57）；CCoV-II亚型分析显示，在28 CCoV毒株中，26个毒株属于CCoV-IIa型。在日本，Soma等［19］报道，CCoV在腹泻犬粪便样品中的阳性率为50.46%（55/109），其中CCoV-I占65.45%（36/55），CCoV-II占72.73%（40/55），CCoVI+II占40%（22/55）；Takano等［20］报道，在CCoV阳性样品中，CCoV-I占88.9%，CCoV-II占7.4%。在韩国，Jeoung等［21］对22个韩国CCoV分离株M基因进化树分析发现，韩国毒株分成四个进化群，即韩国CCoV毒株群、CCoV-II和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）群、CCoV-I亚群和CCoV-I+II中间群。在土耳其，Yesilbag等［22］报道，CCoV在犬腹泻粪便中阳性率为15.56%（14/90），其中CCoV-I型毒株为35.71%（5/14）。在美国，Licitra等［23］报道，在11份CCoV阳性样品中，9份样品为CCoV-II阳性，其中5个样品为CCoV-IIa，1个样品为CCoV-IIb，其他3个样品不能被分型。在巴西，Costa等［12］调查显示，CCoV在腹泻犬样品中阳性率为12%（30/250），其中CCoV-I阳性率为3.2%（8/250），CCoV-II阳性率为7.6%（19/250）；CCoV-II亚型分析显示，在17个CCoV毒株中，9个毒株为CCoV-IIa，其中7个毒株与CCoV-I共感染。目前，有限的分子流行病学数据显示，不同基因型的CCoV毒株在世界范围犬群中均有报道，但是不同CCoV基因型毒株所占比率有所不同。在亚洲、欧洲、南美洲和北美洲地区中，CCoV-II是主要流行的基因型，但是，在个别地区，CCoV-I是主要流行的基因型。

2 犬冠状病毒的重组与变异

冠状病毒是一类具有囊膜的RNA病毒，可感染动物和人；依据其血清型和基因型特征，又可进一步分为Alpha-、Beta-、Gamma-和Delta-冠状病毒属。自SARS-CoV和MERS-CoV爆发后，冠状病毒重组与变异，尤其是冠状病毒跨种传播，成为该领域的研究热点［24］。冠状病毒具有较高重组和突变的可能性，主要由于三个方面的因素［25］：首先，尽管冠状病毒编码的非结构蛋白nsp14具有3’→5’核酸外切酶校对活性，但是，在病毒每一次复制过程中，病毒基因组每1个位点的突变率仍然能达到2.0×10-6，所以冠状病毒的RNA依赖性的RNA聚合酶（RdRp）具有较低的保真度；其次，冠状病毒具有一个使用转录调控序列（TRS）模式的独特RNA复制机制，即拷贝选择（“copy choice”）机制，它能诱导冠状病毒发生同源RNA重组；最后，冠状病毒是RNA病毒中基因组最大的，容易发生异源重组，例如Beta-冠状病毒A亚群成员具有来源于C型流感病毒的血凝素酯酶基因。

作为冠状病毒科的一个成员，CCoV包括CCoVI和CCoV-II（a/b）基因型，因不同CCoV基因型毒株在犬体内共感染等因素，近年来CCoV重组和变异毒株已被报道。由于猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）与CCoV-II高的遗传相似性以及两病毒基因组中ORF3的存在，Lorusso等［26］推测，TGEV是通过病毒的跨种间传播起源于CCoV-II型毒株。Decaro和Erles等［27-28］报道了可能来自于与TGEV S蛋白N-端重组的新CCoV-II分离株，即TGEV-like CCoV毒株，因此CCoV-II被分为CCoV-IIa和CCoV-IIb。Decaro等［13］在欧洲地区调查了TGEV-like CCoV亚型毒株分布，大约20%CCoV-II样品含有TGEV-like亚型。Regan等［29］报道，在CCoV-I和CCoV-II型之间发生重组的毒株CCoV-A76，CCoV-A76毒株具有不同的宿主细胞嗜性。Licitra等［11］建议，CCoV-A76毒株作为CCoV-IIc亚型代表毒株。Terada等［30］报道，在日本，3个猫冠状病毒II型（FCoV-II）毒株的出现是通过FCoV-I、CCoV-II和亲本毒株之间的同源重组，试验结果支持致病性的FCoV出现由于猫和犬冠状病毒的同源重组。这些报道表明，CCoV重组发生是一个复杂过程，CCoV各型之间，CCoV与FCoV之间，CCoV与TGEV之间，均存在着潜在重组的可能性。

3 展望

面对CCoV不同基因型混合存在以及CCoV重组和变异问题，后续研究工作应加强对CCoV分子流行病学调查研究，揭示不同地区CCoV基因型分布情况，监测CCoV重组和变异毒株，明确不同CCoV基因型毒株，尤其是重组或变异毒株的致病性。另外，针对CCoV新基因型和高致病性毒株的出现，在未来研究中应使用新的CCoV变异毒株制备疫苗，解决传统CCoV灭活疫苗针对变异毒株免疫保护效果不佳的问题，进而达到有效预防CCoV流行毒株的感染。总之，CCoV已经由高发病率、低死亡率的一般性腹泻病，转变为高致病性、易变异的犬肠道传染病病原，在未来研究中应该高度重视。

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Update on Genotyping and Recombination of Canine Enteric Coronavirus

W ang Xinyu，Sun Dongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Canine coronavirus（CCoV）belongs to the genus Alphacoronavirus and species Alphacoronavirus-1 along with feline coronavirus（FCoV）and transmissible gastroenteritis virus of swine（TGEV）.CCoV infection causes the puppies suffer from nonfatal mild diarrheic，presents the characteristics of the high prevalence and low mortality rates，when it is mixed with other intestinal pathogen infection，it can lead high mortality rate of sick animals.Recently，as the constantly report of CCoV variation of highly pathogenic strains in European state，and the disease aroused widespread concern again.In order to know more about the canine corona virus genetic evolution，this study reviews of research progress of the canine corona virus genotypes and recombination，provides reference for further research of CCoV.

CCoV；genotype；variation

S815.4

A

1002-2090（2016）03-0028-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.006

2015-10-19

黑龙江省高校新世纪优秀人才计划（1252-NCET-016）；黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目（YJSCX2016-Y26）。

王欣宇（1990-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2014级硕士研究生。

孙东波，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：dongbosun@126.com。