高效液相色谱法测定木糖母液及发酵液中单糖含量

孙蕊，王学群，李朝阳，李洪飞，贾鹏禹

（黑龙江八一农垦大学，大庆163319）

高效液相色谱法测定木糖母液及发酵液中单糖含量

孙蕊，王学群，李朝阳，李洪飞，贾鹏禹

（黑龙江八一农垦大学，大庆163319）

建立了木糖母液及其酵母发酵液中葡萄糖和半乳糖含量的高效液相色谱测定方法。测定方法基于铅配位体交换色谱分离模式，色谱分离柱采用Sepax Carbomix Pb-NP5（300×7.8 mm ID，5 μm，8%交联度）色谱柱，柱温75℃；流动相采用超纯水（100%），泵速0.55 mL·min-1；示差折光检测器温度30℃；木糖母液样品采用固相萃取脱色前处理，母液的发酵液样品采用乙腈沉淀蛋白前处理。在最终的方法条件下，葡萄糖和半乳糖组分在25 min内完成基线分离，在0.2～10.0 mg·mL-1浓度范围内呈现良好的线性关系，方法检测限分别为0.124 mg·mL-1和0.115 mg·mL-1。仪器系统简单，方法重现性好，结果准确。

葡萄糖；半乳糖；木糖母液；发酵液；高效液相色谱法

木糖由酸水解玉米芯等天然半纤维素经净化、结晶等工艺制成，一般用做加氢生产木糖醇的初级产品。木糖企业在制得结晶木糖的同时，离心分流出大量木糖结晶后残液（木糖母液），以往母液被廉价出售用于生产焦糖色素［1，6］。近年来，模拟移动床（SMB）色谱分离成为木糖母液中单糖高效回收利用的重要技术［2-5］，该技术手段不但可得到高纯木糖，同时可得到高纯、高附加值的阿拉伯糖，现已实现技术转化并达到规模化生产。木糖母液中除了含有木糖和阿拉伯糖以外，还含有葡萄糖和半乳糖等杂糖组分，葡萄糖的存在增加了糖液的黏度，影响料液传质速度［6-7］，同时杂糖组分增加了模拟移动色谱分离难度，所以在回收利用木糖母液之前一般采用酵母发酵去除母液中的葡萄糖［6］，也有报道有些酵母也可同时去除母液中的半乳糖［8］；实践证明，在模拟移动床分离母液后的木糖收集液中存在少量半乳糖会影响木糖的结晶得率和产品纯度。因此，工艺流程中葡萄糖和半乳糖的组分含量是调控和评价木糖母液模拟移动色谱回收工艺及产品纯度的重要技术指标。

由于木糖母液及其发酵液样品基体十分复杂，对其组分测定方法提出了更高的要求，其中单糖分析方法一直受到众多科研工作者的关注。针对葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖4种常见半纤维素来源的目标成分，孙广仁等利用钠型配位体交换树脂色谱柱分离检测木糖母液中的单糖组成，但是半乳糖和阿拉伯糖无法分离［8］，而利用钙型配位体交换树脂检测单糖，木糖和半乳糖无法分离［9］；另有采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生单糖组分结合紫外-可见检测器测定木糖液中的多种单糖［10-12］，但方法样品前处理较为耗时且果糖衍生效果较差。利用铅型配位体交换色谱分离柱，结合固相萃取等样品前处理方法，检测了木糖母液及其酵母发酵液样品中葡萄糖及半乳糖含量，建立了铅配位体交换结合示差折光检测高效液相色谱测试方法，所建检测方法可为木糖生产企业工艺过程中目标物监测及木糖、阿拉伯糖产品质量检验提供准确数据。

1 实验部分

1.1 仪器

高效液相色谱仪（型号：LC-20AT日本Shimadzu公司），配备：在线真空脱气机、高压恒流泵、恒温柱温箱、示差折光检测器、LC solution色谱工作站；电子分析天平（感量：0.000 1 g瑞士梅特勒公司）；离心机（最大转速：16 000 rpm上海安亭科学仪器厂）；固相萃取仪（位数：20美国沃特世公司）；超纯水机（型号：Master-E上海和泰仪器有限公司）。

1.2 试剂、实验材料

D-半乳糖、D-葡萄糖（标准品，国药集团化学试剂有限公司）。实验所用乙腈为HPLC级、水为超纯水，其他实验试剂均为进口光谱级或分析级试剂；木糖母液由黑龙江省鹤岗市经纬糖醇有限公司提供（糖度Brix 60.7%），发酵液由实验室利用木糖母液加入啤酒酵母经发酵获得。

1.3 标准工作曲线绘制与样品前处理

精密称取D-半乳糖和D-葡萄糖标准品各0.1 g，精确至0.000 1 g，用超纯水溶解标准品并定容至于10 mL棕色容量瓶中，配制成2种单糖的混合标准储备溶液，储备液4℃保存，分析前用水逐级稀释为系列标准工作溶液。标准工作溶液经0.45 μm的水相滤膜慢速过滤后上机分析，以各标准工作液浓度对应峰面积做标准工作曲线，计算得出线性回归方程。

精密量取木糖母液样品2 mL用纯水稀释后定容至200 mL容量瓶中，待混匀后量取定容溶液5 mL滴入经80%（v/v）乙腈预活化的活性炭固相萃取小柱内，在负压下收集流出液，先弃去前3 mL液体，收集后2 mL流出液，该液经0.45 μm的水相滤膜过滤后上机分析。

精密量取木糖母液的发酵液样品10 mL用纯水稀释后定容至200 mL容量瓶中，待混匀后量取稀释液5 mL加入1 mL乙腈，剧烈震荡1 min，静止后以12 000 rpm转数离心10 min，取上层清液经0.45 μm的有机相滤膜过滤后上机分析。

单一标准品保留时间定性，峰面积外标法或峰面积归一化法定量。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：赛分Carbomix Pb-NP5（300×7.8 mm ID，5 μm，8%交联度），配同系保护柱Carbomix Pb-NP5（50×7.8 mm ID，5 μm，8%交联度）；流动相：超纯水（100%）；泵速：0.55 mg·mL-1；经典柱压：37 bar；柱温：75℃；示差折光检测器温度：30℃，响应时间：6 s；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 方法适应性考察

实验对木糖母液（A）及其发酵液（B）样品中目标组分的分离情况进行了方法适应性考察。由图1可见，样品色谱图峰数5个，各峰由标准品保留时间定性，其中葡萄糖（1）和半乳糖（3）分别在14.95 min和17.53 min处被流动相洗脱，目标峰位无杂峰干扰；谱图中样品A和B的叠加曲线显示，木糖母液经酵母发酵后葡萄糖被分解去除，而半乳糖未受到影响。

2.2 分离柱的选择与色谱柱温的优化

实验比较了不同填料粒径铅配位体交换柱对样品中主要组分分离效果的影响，对比实验采用了Sepax Carbomix Pb-NP10（300×7.8 mm ID，10 μm，8%交联度）色谱柱，全水流动相，流速0.55 mL·min-1，柱温75℃，示差折光检测器温度30℃。结果表明，样品在相同的色谱条件下，各组分在小粒径填料（5 μm）下表现出更高的分离度，同时各组分保留时间稍有延长，其原因在于各组分在分离过程中因填料粒径变小而增大了保留面积，从而增加了柱效，使得各组分能够基本实现基线分离。因此实验采用5 μm铅（Pb2+）配位体填料色谱柱进行实际样品分离，以获得更高的目标组分选择性；由于低交联度聚合物填料基质刚性较差，色谱柱长时间运行压力耐受性欠佳。因此，实验选用填料刚性更强的8%交联度树脂［9］。

图1 样品色谱图Fig.1 Chromatogram of sample

以聚合物基质为主的配位交换色谱柱在分离糖醇化合物时一般需要在高的色谱柱温度（一般80℃）下运行，由于高温降低了流动相的黏度，使得填料溶胀好，系统运行压力小，不易损伤刚性较差的聚合物填料；另外柱温升高可以有效的改善组分峰型，防止谱峰拖尾或裂峰现象的发生，但过高的柱温也可导致色谱柱填料的损害［13］。由于实验使用了气浴加热式柱温箱，由于气浴式加热存在热量损失，为保证色谱柱内温度稳定性，柱温箱实际设置温度较色谱条件温度提高2℃，设定为77℃。

2.3 样品前处理

在木糖生产工艺过程中，木糖液经净化工艺已基本脱除灰分杂质和颜色，在即将进行木糖结晶的前段工艺需要进行单效或多效浓缩，在此工艺中由于高温产生了少量焦糖色素，在结晶工艺中这些色素集中进入木糖母液［1］。木糖母液中含有大量因浓缩产生的呈褐色的焦糖色素，这些色素等大分子杂质进入色谱柱后会对色谱柱填料造成吸附性损伤，因此实验采用了固相萃取方法进行样品去杂质处理，在固相萃取装置的负压条件下，样品溶液中的色素杂质在经过装有活性炭的柱管时被活性炭吸附去除，目标物糖类化合物不受吸附进入收集管，收集液经微米级滤头过滤进行上机检测。

木糖母液经过加入啤酒酵母发酵后的料液中含有约0.3%的残余酵母，由于木糖母液经水稀释后发酵，所以发酵液样品在分析时色素含量很低，可以忽略其干扰，只需去除残余酵母蛋白即可，实验采用加入乙腈沉淀酵母蛋白，经高速离心后取上清液过滤上机分析。

2.4 回归方程、线性范围与检测限

实验考察了两种单糖组分的方法学指标。针对标准品浓度的上下限考察了组分分析的线性范围，根据峰面积Y对各单糖浓度X（mg·mL-1）进行线性回归，得出线性方程和相关系数，并依据三倍噪声计算检测限，结果见表1。

表1 线性回归方程Table 1 Linear regression equations

2.5 方法精密度和回收率

为验证所建检测方法的精密度，实验设计考察了6个平行样品的重现性情况，即在单批次木糖母液及其对应发酵液样品中各自精密量取待检样品6份，按照样品前处理流程分别进行前处理，每类样品共进样6次，记录并计算2种组分峰面积的相对标准偏差，葡萄糖和半乳糖的精密度（RSD，n=6）分别为：2.13%和2.56%，相对标准偏差均小于4.6%，方法的稳定性较高；实验采用实际样品中定量加入混标的方式进行方法回收率测试，采用峰面积外标法定量测定加入标准品前后的组分含量，依据含量计算得出葡萄糖平均回收率在98.9%～101.6%之间，半乳糖平均回收率在98.1%～100.9%之间，方法前处理得当，重现性好。

2.6 样品测试结果

实验利用峰面积外标定量方法对3个不同批次的木糖母液及对应发酵液中葡萄糖和半乳糖2种单糖含量进行了实际检测，不同批次所得各结果见表2，由结果可见采用常规酵母可稳定去除木糖母液中的葡萄糖组分，但半乳糖组分在本实验中未受到酵母发酵影响，这与孙广仁等［8］的研究结果略有不同，其原因最大可能为酵母类型不同导致利用转化单糖种类不同。

表2 样品测定结果Table 2 Test results of samples

3 小结

利用二价铅离子型配位体交换单糖分离模式结合示差折光检测器检测，所建立的高效液相色谱方法实现了木糖母液及其发酵液中葡萄糖和半乳糖的分析和含量的测定。采用更小粒径填料大大增加了组分分离效能，流动相采用超纯水运行，对环境无危害，所需仪器配置较低，所建方法简便易操作，重现性好，此法可为木糖母液模拟移动床色谱回收工艺过程的控制及产品质量控制提供准确的测试数据。在方法实际运用中，小批量样品可采用纯水稀释后滤膜过滤方式直接进样，大批量样品测试考虑到样品中杂质对色谱柱的污染，需采用对应的样品前处理方法，此方法仪器配置中示差折光检测器可采用蒸发光散射（ELSD）检测器代替以提高方法灵敏度。

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Determ ination of M onosaccharides in Xylose M other Liquor and Fermentation Solution by HPLC

Sun Rui，W ang Xuequn，Li Chaoyang，Li Hongfei，Jia Pengyu
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The determination method of glucose and galactose in xylose mother liquor and its yeast fermentation solution was established with HPLC.The method was based on seperation mode called lead ligand exchange.A Sepax Carbomix Pb-NP5（300× 7.8 mm ID，5 μm，8%crosslinkage）column was used for the seperation with ultra-pure water（100%）as mobile phase.The pump rate of mobile phase was 0.55 mL·min-1at a column temperature of 75℃.Temperature of refractive index detector（RID）was 30℃. Xylose mother liquor was pretreated by solid phase extraction（SPE）to remove colourings，fermentation solution was pretreated by acetonitrile to precipitate protein.Baseline separation was achieved within 25 min at final conditions.The calibration curve was linear in the mass concentration range of 0.2～10.0 mg·mL-1，the LOD of glucose and galactose were 0.124 mg·mL-1and 0.115 mg·mL-1respectively.The instrument system was simple，and method was accurate and reproducible.

glucose；galactose；xylose mother liquor；fermentation solution；HPLC

O657.72

A

1002-2090（2016）03-0078-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.016

2015-03-10

黑龙江省教育厅项目（12541591）。

孙蕊（1984-），女，实验师，齐齐哈尔大学毕业，现主要从事仪器分析的研究工作。

贾鹏禹，男，助理研究员，E-mail：jiapengyu@126.com。