基于SSR技术的水稻DNA指纹图谱构建

赵雅楠，王颖，2，张东杰，沈琰，杨义杰

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心/黑龙江八一农垦大学）

基于SSR技术的水稻DNA指纹图谱构建

赵雅楠1，王颖1，2，张东杰1，沈琰1，杨义杰1

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心/黑龙江八一农垦大学）

水稻是我国重要的粮食作物，具有种植面积大、分布范围广等特点，然而由于水稻的遗传基础比较狭窄，在新品育种、品种区分及质量监控等方面经常出现问题。SSR技术作为第二代分子标记的典型代表，具有标记数量丰富、定位精准等优点，在水稻SSR指纹图谱的构建中提到不可替代的重要作用。该文主要综述了基于SSR技术构建的水稻DNA指纹图谱，对其技术要点及其构建意义进行分析，并对其发展趋势进行展望。

SSR技术；水稻；DNA指纹图谱

“民以食为天”体现出人类与粮食作物的密切关系，水稻作为我国最重要的粮食作物，与人们的生活密不可分。近些年，我国水稻种植大面积推广，随着水稻产量的大幅度提高，一系列问题也接踵而来，假冒伪劣稻米以次充好、新品育种难度大、杂种优势不明显等都制约着我国水稻产业的发展，因此，研究快速、准确的品种鉴定技术，为水稻的遗传多样性分析及种质资源鉴定等提供依据迫在眉睫。“DNA指纹”的概念由英国遗传学家Jefferys在1985年第一次提出，正式将“指纹”一词引入到现代分子生物学中[1]，随后DNA指纹图谱技术应运而生。SSR技术作为第二代分子标记的典型代表，具有数量丰富、定位准确等特点，是一种较为理想的分子标记技术，在水稻DNA指纹图谱的构建过程中起到不可替代的重要作用。

1 DNA指纹图谱技术及分类

DNA指纹图谱是指在DNA水平上建立像人类指纹一样具有特异性、可以区别品种及个体间差异的图谱，标记数量多，不受外界环境及作物发育阶段的影响，多态性高，结果稳定、可靠，且操作简单，自动化程度高，提取出的DNA样品可以保存较长时间，适用于仲裁性或者溯源性鉴定[2-5]。目前，DNA指纹图谱技术可以分为RFLP、RAPD、AFLP、SSR四类。

RFLP标记由Grodzicker等创立于1975年，是研究最早的一类分子标记技术，标记数量大，可以区别纯合型基因或者杂合型基因，但操作复杂，费用昂贵，需要使用放射性同位素，有害人体健康[6-8]，因此限制了其在DNA指纹图谱中的应用；RAPD标记由Williams和Welsh在1990年创立，灵敏度高，检测成本低，只需要少量的DNA样品即可，但存在基因迁移的可能性，因此重复性较差[9-11]；AFLP标记由Zabeau在1993年创立，是一类与PCR技术紧密结合的分子标记技术，具有较好的重现性，适用范围广，但是试剂盒价格昂贵，实验成本高，要求提取出的DNA纯度极高，实验人员的工作难度较大，此外，AFLP技术已经被一些国家申请专利，因此该技术在商业及生产上的应用推广存在一定的限制性[12-15]。

SSR又称微卫星序列，是在真核生物中普遍存在的一段由1-6个碱基组成的重复序列，大约每10～50 kb就存在一个微卫星[16-18]。SSR技术主要利用基因中SSR序列两端具有保守性的特点为其设计引物，经PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或者浓度较高的琼脂糖凝胶电泳以分析DNA的多态性。SSR标记与PCR技术紧密结合，是当前应用时间最长，涉猎范围最广的新型DNA标记技术，具有结果重复性好、可信度高、操作简便，成本低等特点。与此同时，目前有一部分作物的SSR序列已经公布，可以供人们直接使用，并且随着SSR位点的不断开发，该技术必将成为作物品种鉴定、指纹图库构建等领域的中坚力量[19]。

2 SSR标记技术要点

SSR技术具有操作简单、遗传信息完整、结果可信度高等特点，广泛应用于水稻的DNA指纹图谱构建之中。水稻SSR指纹图谱构建主要经过核心SSR引物筛选、DNA提取、PCR扩增、产物分离等步骤[20]。

2.1 SSR引物的获取

SSR引物是两段人工合成的寡核苷酸序列，PCR的过程中在特定位置与目的DNA互补，充当核苷酸在聚合反应时的起始点。传统的水稻SSR引物获取方法是在NCBI、DDBJ、EMBL等数据库检索，近些年，随着二代测序时代的到来，水稻SSR引物的开发也有了新突破。二代测序技术具有高通量、低成本、简单便捷等特点，可以将庞大、复杂的水稻基因组简化，通过分析基因组中个别具有代表性的小DNA片段进而探索整个基因组特征，其中比较常见的是RAD-seq技术。该技术利用限制性内切酶对DNA进行处理，对获得的小片段建库、测序，最后检索出片段中的SSR位点。Sun等[21]利用两种不同的限制性内切酶对水稻基因组进行处理，得到25 000个DNA片段，采用Illumina GAⅡ读取其中90%的片段，占该水稻全基因组的82%，读取的重复片段为19%，证明简化基因组应用于水稻种质研究中是可行的。

2.2 DNA提取

水稻的DNA提取是构建SSR指纹图谱的基础工作，在提取的过程中要尽可能的保证DNA的完整性，在避免受到有机溶剂、金属离子以及其它核酸分子污染的基础上，将蛋白质、多糖以及酚类等含量降低。目前常用的DNA提取法主要包括CTAB法、SDS法、DNA试剂盒提取法和磁珠法核酸纯化法等。SDS法操作步骤少，操作简单快捷，但主要是针对蛋白质含量较多的作物，不适用于水稻的提取；磁珠法核酸纯化技术自动化程度高，可以减少手工操作程序，但目前很少应用于植物DNA提取中。DNA试剂盒可以避免使用酚和氯仿，安全可靠且提取率高，但操作烦琐，成本较高，其中CTAB法是目前应用最多的DNA提取方法。赵国珍等[22]开发出一种高效的水稻DNA提取方法，成本较低，提取一份样品只需0.1元，操作快捷，每小时可完成近百个样品的提取，设备要求低，可直接提取水稻干种子，特别适合水稻SSR研究。Wang等[23]开发出一种以超声波温育为前处理的CTAB法提取水稻DNA，发现该法提取质量和提取效率都明显优于传统方法。

2.3 聚合酶链式反应

PCR（聚合酶链式反应）是上个世纪80年代产生，用于扩增特定DNA的分子生物学技术。其原理主要是利用DNA在95℃的体外环境下会变成单链，在60℃时可以与引物结合，在70℃左右时可以使DNA聚合酶合成互补链，可完成DNA扩增的特点。SSR-PCR体系中含有较多的影响因子，如DNA模板浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等都对PCR扩增效果的影响十分明显[24-26]，因此通常都要进行PCR条件的探索和优化，探究同一PCR体系下各个影响因子的最佳配比。近些年，随着分子生物学的不断发展，SSR-PCR技术也得到优化，逐渐向操作简便、快捷高效的趋势发展。罗天宽[27]等研究出一种应用水稻叶片直接PCR的方法，省去了DNA的提取过程，直接以叶片为模板，加入0.8%PCR增强剂，发现检测效果与传统PCR差异不显著。魏霜等[28]对水稻的多重PCR反应进行研究，成功建立了七重PCR体系，发现相较于单一PCR体系，多重PCR检测速度快，效率高，结果准确。

2.4 产物分离

PCR产物分离是SSR技术中难度较大的关键环节，对后续的数据处理、结果分析等起到重要作用。目前在水稻SSR指纹图谱构建中常用的分离技术主要包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光标记毛细管电泳检测法。琼脂糖凝胶电泳可分离分子量在0.2～20 kb范围内的DNA分子，操作简便，不需预处理，可直接在紫外光下观察条带情况[29]，但在制胶过程中需要使用具有致癌性的溴化乙锭，有害人体健康，且琼脂糖的分辨率不高，在引物筛选及品种鉴定方面效果不佳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离分子量在1～500 bp的核苷酸片段，其分辨率高于琼脂糖凝胶，但仍不能准确读取DNA片段的大小，易出现误读，且操作复杂，检测耗时长、效率低，不适合大规模、多批次的处理样品[30]。荧光标记毛细管电泳检测法是一种高效、精准的检测技术，能够识别1～2个碱基片段之间的差异，是目前较先进的产物分离技术。程本义[31]等以16份杂交水稻为模板建立SSR荧光标记体系，发现荧光标记毛细管电泳检测技术数据精准，结果可靠，检测效率和质量俱佳。

3 SSR标记的优势与不足

SSR标记作为第二代分子标记技术的典型代表，较于其他分子标记技术具有十分突出的优点。首先，SSR标记以核酸为研究单位，能够在DNA水平上评价个体或种群之间的差异，不受周围环境、采样时间、DNA来源组织或器官的影响，不涉及基因是否表达等问题。其次，植物中的SSR数量丰富，分布广泛，能够开发的标记几乎是无限的。第三，SSR标记符合孟德尔定律，呈共显性，能够区分纯合型或杂合型基因。最后，SSR标记对DNA纯度及数量要求不高，即使部分DNA降解也可以完成分析[32-36]。由此可见，SSR标记的优越性十分明显，但同时也存在一定的局限性。首先，由于SSR的进化具有不确定性，DNA分子的突变机理及突变方向仍饱受争议，尚未探究清楚，需要根据不同品种设计不同的特异性引物。其次，部分SSR标记位点与功能位点存在不同程度的差异，这种不一致使分子标记与目的基因之间存在一定的遗传距离，进而会在后续的分子辅助选择中出现一定的不准确。最后，由于SSR技术起步较晚，有很多与控制重要农艺形状目的基因相关联的分子标记还没有准确定位，这在一定程度上影响了分子标记的质量[37-39]。

4 展望

SSR标记具有多态性丰富、操作简单等优点，在水稻的种质资源鉴定、遗传多样性分析等领域体现出重要应用价值。基于SSR技术构建水稻DNA指纹图谱是分子标记技术迅速发展的标志，是快速、准确鉴定常规水稻真实性及纯度的重要技术体系，是保护稻米种权、拓宽水稻遗传基础的必经之路。随着水稻基因组测序工作的快速推进，越来越多的满足SSR标记的等位基因位点将会呈现在人们面前。此外，荧光素标记法、毛细管电泳技术等也逐渐成熟，对水稻SSR指纹图谱的应用起到巨大推动作用。毋庸置疑，水稻SSR指纹图谱技术的不断发展必然会为水稻的基因组研究、品种真伪鉴定、遗传分析等提供有力支持，因此，水稻SSR指纹图谱意义重大，值得大力推广。

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Fingerprint Construction of Rice DNA Based on the SSR Molecular Marker Technology

Zhao Yanan1，Wang Ying1，2，Zhang Dongjie1，Shen Yan1，Yang Yijie1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy，Daqing 163319；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy）

Rice was one of the most important crops in China，with large planting area，and wide geographical distribution scope. However，for the narrow genetic basis，problems always emerged in new variety breeding，quality control and other aspects of distinction.SSR technology typically presented the 2nd generation of molecular marking，had the advantages of large amount，spicific location plays an irreplaceable role in SSR fingerprint construction.The article reviewed the recent development of DNA fingerprint construction based on SSR technology.Key technology elements and significance of fingerprint construction，and new trend of this area was also discussed.

SSR；rice；DNA fingerprint

S511

A

1002-2090（2016）05-0032-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.006

2015-09-28

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2012BAD34B02）；黑龙江省应用技术与开发重大项目（GA14B104）；黑龙江省农垦总局“十二五”重点科技计划项目（高产金属硫蛋白菌株的选育及其高效纯化技术研究：HNK125B-13-05）；大庆科技局创新项目（杂粮及其深加工分析测试技术平台建设：sjh-2013-65）。

赵雅楠（1993-），女，黑龙江八一农垦大学食品学院2015级硕士研究生。

张东杰，男，教授，博士研究生导师，E-mail：byndzdj@126.com。