环介导等温扩增技术的应用研究进展

王德国， 刘海英,王爱萍

(1.许昌学院 食品与生物工程学院，河南省博士后研发基地，河南 许昌 461000；2.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450000)

环介导等温扩增技术的应用研究进展

王德国1， 刘海英1,王爱萍2

(1.许昌学院 食品与生物工程学院，河南省博士后研发基地，河南 许昌 461000；2.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450000)

主要论述环介导等温扩增产生假阳性的两个可能原因以及围绕这两个方面国内外的研究动态,从而为解决环介导等温扩增技术的应用瓶颈提供理论基础.

环介导等温扩增；假阳性；气溶胶污染；非特异性扩增

日本学者Notomi 等在2000年发明报道了环介导等温扩增技术[1]，截至目前该报道已被英文论文引用2 199次，该技术通过多对引物实现巧妙的扩增，环介导等温扩增反应效率非常高.由于无温度变化的耗时，2002年环引物的提出又进一步缩短了反应时间[2]，所以环介导等温扩增在反应速度、特异性、灵敏度方面优于链式聚合酶反应(PCR)[3-4]、核酸序列依赖性扩增(NASBA)[5-6]、链替代扩增反应(SDA)[7]、滚换扩增反应(RCA)[8]和解链酶扩增(HAD)[9].然而，环介导等温扩增技术虽然经过近十五年的研究开发，仍然没有实际应用，主要是由于这种分子生物学检测方法假阳性率高.起初绝大多数研究人员认为气溶胶污染是产生假阳性的主要原因，所以大部分研究都是围绕气溶胶污染问题展开的，研究扩增产物检测方法，以实现不开盖检测；现在人们都认为非特异性扩增是引起假阳性的主要原因，所以解决非特异性扩增问题逐渐成为该领域的研究热点.

1 扩增结果的判读方法研究

1.1 电泳法

扩增后用2%琼脂糖电泳分析扩增产物[10-11]，但电泳法需要用高致癌性的荧光染料,如溴化乙锭等，既危害操作人员的健康，又会产生所谓的气溶胶污染[12].

1.2 浊度法

通过扩增产生的副产物焦磷酸根与镁离子形成的沉淀物，用肉眼观察扩增体系的浑浊度来判断扩增结果[13]，由于扩增反应产生的浑浊度不明显，所以浊度法检测容易受检测人员主观因素的影响.

1.3 荧光染料法

扩增反应结束后，向反应体系中加入SYBR Green I、PicoGreen等类似的荧光染料[14-15]，通过荧光强度的变化，判断扩增结果.荧光染料法主要是基于扩增产物DNA进行检测，染料分子插入到DNA双螺旋中荧光强度增大，进而判断扩增结果，而LAMP反应需要多对引物，引物二聚体的产生是难以避免的，也就无法排除二聚体引起的假阳性问题[16-17]，并且扩增后开盖加入荧光染料还易引起气溶胶污染.

1.4 金属离子指示剂

为了避免上述荧光染料对扩增结果的误判，日本荣研化学株式会社采用钙黄绿素检测副产物焦磷酸根来判断扩增结果[18]，在一些报道中还采用金属离子指示剂羟基萘酚蓝来判断扩增结果[19-20]，这些金属离子指示剂可以提前加入到反应体系中，就实现了不开盖检测.

1.5 免疫侧向层析试纸

通常采用生物素和异硫氰酸荧光素分别标记环介导等温扩增的引物，扩增后采用印有生物素亲和蛋白(avidin)及异硫氰酸荧光素抗体的试纸条检测[21].免疫侧向层析试纸需要扩增反应后开盖上样层析，由于扩增后产物量为109，开盖后容易引起气溶胶污染，从而降低实用性.

有一种商业化销售的产品融合了恒温扩增、核酸杂交、核酸试纸条三种技术，既克服了气溶胶污染，又避免了引物二聚体引起的假阳性问题.

1.6 实时浊度仪法

通过实时浊度仪如LA-320c监控反应过程，判断扩增结果[22].但目前实时浊度仪的市场价格40万左右，远高于PCR仪的价格，就限制了该技术的推广应用.

目前该领域的科研工作者普遍认为环介导等温扩增技术灵敏度高，容易产生气溶胶污染，交叉污染是导致假阳性率高的主要原因，所以在实现不开盖检测方面做了大量研究与尝试，扩增产物的检测手段近乎完美，尤其是最近提出的巨磁阻检测方法[23]，但环介导等温扩增还不能实际应用.

2 非特异性扩增研究

环介导等温扩增通过多对引物实现巧妙扩增，使用多对引物难免会形成引物二聚体和出现非特异性扩增，特别是在环介导等温扩增反应中引物、镁离子、dNTP和酶的浓度比Real-time PCR中的高出好几倍.在Real-time PCR研究中，为了避免非特性扩增,需要严格控制并优化这四个因素的浓度，越来越多的研究人员认为,导致环介导等温扩增假阳性率高的主要原因是引物二聚体引起的非特异性扩增.

早在2009年，Sulong Li等研究应用环介导等温扩增检测食源性致病菌志贺氏菌，设计了两套引物，其中一套存在非特异性扩增，首次提出了环介导等温扩增中非特异性扩增的现象，强调了引物设计的重要性，并对引物筛选提出了一些实用性建议[24].Sulong Li等提出了LAMP检测方法的相对特异性观点，揭示了非特异性扩增是引起假阳性的主要原因，而非实验污染，相关研究成果获2009年中国国家质检总局科技兴检三等奖[25].

为了降低非特异性扩增反应，Gandelman等尝试采用茎引物(Stem Primers)替代环引物(Loop Primers)改进环介导等温扩增技术，指出环引物比茎引物更容易引起引物二聚体间的相互反应和非特异性扩增[26].孟兆祥等提出了一种DNA扩增的新方法，利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应，尝试从另外一个角度解释环介导等温扩增技术中的假阳性反应[27].

3 展望

环介导等温扩增技术主要的应用瓶颈是假阳性率高，可能的原因包括气溶胶污染和非特异性扩增，目前气溶胶污染引起的假阳性问题已经解决，因此如何解决非特异性扩增产生的假阳性问题就成为研究热点.该问题一旦解决，环介导等温扩增技术必将成为检测领域一个强有力的分子生物学诊断手段.

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责任编辑：卫世乾

Progress in Research and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification

WANG De-guo1， LIU Hai-ying1, WANG Ai-ping2

(1.HenanPostdoctoralResearchBase,FoodandBioengineeringCollege,XuchangUniversity,Xuchang461000,China；2.LifeScienceCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

We discussed two potential reasons for the false positive in loop-mediated isothermal amplification and research trend at home and abroad on these two aspects,providing theoretical basis for the solutions to the bottleneck problem in loop-mediated isothermal amplification.

loop-mediated isothermal amplification; false positive; aerosol pollution; non-specific amplification

2015-02-23

国家人力资源和社会保障部留守人员科技活动项目；河南省高等学校科技创新团队支持计划(15IRTSTHN016)；河南省人社厅博士后研发基地项目；许昌市科技发展计划项目(1504005)

王德国(1975—)，男，山东菏泽人，副教授，博士，研究方向：食源性致病微生物分子生物学快速检测方法.

1671-9824(2016)02-0069-04

Q81

A