中华绒螯蟹可视荧光标记应用研究

李晶晶，耿绪云，董学旺，魏俊利，孙金生，3，邱高峰

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2.天津市水生动物疫病预防控制中心，天津300221；3.天津师范大学生命科学学院，天津300387）

中华绒螯蟹可视荧光标记应用研究

李晶晶1，2，3，耿绪云2，董学旺2，魏俊利2，孙金生2，3，邱高峰1

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2.天津市水生动物疫病预防控制中心，天津300221；3.天津师范大学生命科学学院，天津300387）

采用红色可视嵌入性荧光（visible implantelastomer，VIE）标记中华绒螯蟹（Eriocheir Sinensis），观察了荧光标记在中华绒螯蟹中的保持率和对其存活、生长、发育及繁殖的影响。荧光标记幼蟹不同部位在室内饲养并观察8周，结果表明，在中华绒螯蟹幼蟹不同部位的标记保持率均为100%，对照组和各试验组幼蟹的存活率无显著性差异（P＞0.05）。荧光标记幼蟹螯掌节和腕节间的关节膜后移入室外养殖池养殖，中华绒螯蟹室外养殖的生长和发育速度与对照组也无显著差异（P＞0.05）。挑选标记后经室外池塘养成的中华绒螯蟹进行小水体繁育实验，抱卵率为83.3%，平均抱卵量30×104egg·ind－1，与未标记中华绒螯蟹小水体繁育实验结果比较，抱卵率、平均抱卵量无显著性差异，荧光标记不影响中华绒螯蟹交配抱卵。本文结果表明，VIE可视荧光标记可作为中华绒螯蟹个体识别标记，应用于育种、资源调查等研究和生产实践。

中华绒螯蟹；荧光标记VIE；存活率；标记保持率；生长；繁殖

中华绒螯蟹（Eriocheir Sinensis）俗称河蟹，是我国重要经济甲壳动物之一，主要分布于长江、辽河、瓯江等水域。经过30余年的发展，中华绒螯蟹养殖规模不断扩大，养殖区遍布我国辽宁、河北、天津、山东、江苏、浙江等沿海省份及广大内陆地区，已成为淡水渔业单品中产值最大的产业。规模化的养蟹业需要大量优质高产的苗种，这就为中华绒螯蟹选育研究和育种生产提出了更高的要求。同时，在市场需求和经济效益的推动下，过度捕捞、生长环境恶化等原因致使中华绒螯蟹自然资源越来越匮乏，增殖放流工作势在必行［1］。育种工作尤其是家系选育，为消除环境差异的影响，确保获得遗传参数的准确性，需要对个体或群体进行标记区分；对增殖放流效果的科学评价也需要对放流生物进行标记和监测，才能有利于渔业资源长期可持续发展。但是，由于中华绒螯蟹的形态和周期性蜕皮的特性限制了常规标记技术的应用。

美国西北海洋技术公司（Northwest Marine Technology，INC）开发生产的可视嵌入式荧光（visible implant elastomer，VIE）标记，通过注射到动物个体的皮下或皮下的肌肉中进行标记，在鱼、虾、蟹等水产动物中取得了较好的应用效果［2－10］，尤其在鱼类中已被广泛用于育种及增殖放流等研究，然而至今未见荧光标记在中华绒螯蟹中应用的相关报道。作者尝试利用可视嵌入式荧光标记中华绒螯蟹，评估其对蟹类存活、生长发育及繁殖的影响，以期为中华绒螯蟹人工选育和增殖放流效果评估提供可靠的标记技术方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验幼蟹取自天津市蟹源水产养殖有限公司河蟹养殖场，平均体长（22.79±1.96）mm，体宽（24.99±2.19）mm，体质量（6.50±1.70）g。置室内水槽充气暂养1周后，选取健康幼蟹标记红色可视嵌入式荧光（VIE）。实验所用荧光标记购自美国西北海洋技术公司。

1.2 实验分组和VIE荧光标记方法

中华绒螯蟹甲壳较厚，透明度差，所以选择可识别度相对较高的部位进行荧光标记试验。标记幼蟹室内观察实验分为对照组（不标记）、复眼眼眶标记组、螯掌节和腕节间的关节膜标记组、腹甲标记组和腹部标记组，每组各30 ind，标记部位如图1所示。

图1 荧光标记部位Fig.1 Diagram of tag locations

依据操作的简易可行性，荧光标记在螯掌节和腕节间的关节膜内比标记其他部位操作更简洁方便，幼蟹蜕壳后标记颜色更清晰，且存活率相对较高。所以，室外养殖实验设置对照组和螯掌节和腕节间的关节膜标记组，每组各250 ind。采用注射方法标记荧光，注射剂量为3～5μL· ind－1，当壳下出现明显的标记斑点时停止注射，将针头缓慢抽出，并用酒精棉球轻按片刻，防止荧光染料溢出。荧光标记过程严格遵照VIE操作说明书（Northwest Marine Technology，Inc.，2008，visible implant elastomer tag project manual）。

1.3 养殖管理

标记的幼蟹于室内养殖8周，对照组和4组标记幼蟹分别置于5个40 cm×60 cm×50 cm塑料培养箱中，24 h连续微充气养殖。水温保持在（23±1）℃，投喂幼蟹配合饲料2次·d－1，日投喂量约为体重的10%。利用虹吸方法清理残饵、注入新水，日换水量50%以上。室外池塘养殖阶段，荧光标记组和对照组分别投放于天津市蟹源水产养殖有限公司相邻两个667 m2的室外土池中，按七里海河蟹生态健康养殖技术规范管理［11］。

1.4 繁育实验

在室外池塘养殖实验中选取荧光标记保持完好的性成熟中华绒螯蟹为亲本进行繁育实验。实验共分为3个平行组，每组4 ind成蟹，按照♀：♂比例3∶1分别置于室内1 m3水体塑料圆缸中，缸底铺设20 cm深的细沙，24 h连续微充气。采用卤淡水勾兑方式逐渐增加水体盐度至20±2，日增加量＜5。投喂鱼肉等高营养饵料，随温度变化调整投喂量，并及时清除残饵。换水次数和换水量视水质而定。经过小水体催情、交配、抱卵和越冬，观测记录抱卵蟹数量及抱卵量。

1.5 数据统计

实验蟹生物学数据以平均值±标准差（Mean ±SD）表示。实验数据采用SPSS 22统计软件进行分析处理，列联表（Crosstabs）分析幼蟹不同处理组存活率差异的显著性；单因素方差分析（One-way，ANOVA）检验不同标记处理组和空白对照组的各项生长指标是否存在显著性差异。应用Excel 2007作图，Photoshop 7.0处理图片。

2 结果与分析

2.1 荧光标记保持率及其对幼蟹存活的影响

幼蟹标记可视荧光后置于室内水槽中养殖，每日观察和记录对照组和各试验组幼蟹存活情况和标记保持效果，按下式计算即时死亡率、存活率和标记保持率。

即时死亡率＝24 h内死亡幼蟹数/每组幼蟹数×100%

存活率＝存活幼蟹数/每组幼蟹数×100%

标记保持率＝能辨识出荧光标记的幼蟹数/用于检测标记保持率的幼蟹数×100%

经过8周的观察和数据统计，不同部位标记的荧光保持率均为100%，标记幼蟹蜕壳正常，且对可视荧光的可视度无明显影响。幼蟹荧光标记24 h后各试验组即时死亡率均为0%，7 d后开始出现死亡现象。8周内，各组存活率如图2所示，对照组存活率为58%，荧光标记组中螯掌节和腕节间的关节膜标记组幼蟹的存活率最高为53.3%，标记在复眼眼眶的一组存活率最低为36.7%，经列联表卡方检验表明各组幼蟹存活率无显著性差异（P＞0.05）。

图2 不同标记部位幼蟹的存活率Fig.2 Survival rate of different tag locations in juvenile crabs

2.2 荧光标记对幼蟹生长发育的影响

室外池塘养殖实验选取荧光标记部位为螯掌节和腕节间的关节膜幼蟹。幼蟹入池前逐个测量初始体长、体宽和体质量生长指标。养成后起捕全部中华绒螯蟹，再逐个测量上述3个生长指标，并检查荧光标记保持效果，计算标记保持率和特定生长率（SGR）。

SGR＝（ln最终数据－ln初始数据）/实验时间×100%

经80 d土池养殖，对照组捕获成蟹109 ind，荧光标记组捕获成蟹103 ind，两组存活率分别为43.6%和41.2%。荧光标记组中VIE标记可识的75 ind（图3），标记保持率为72.8%。对照组和荧光标记组生长指标体长、体宽和体质量变化情况见表1，单因素方差分析表明，荧光标记组与对照组的体长、体宽和体质量均没有显著性差异（P＞0.05），荧光标记对中华绒螯蟹的生长发育没有显著影响。

2.3 荧光标记对中华绒螯蟹繁殖的影响

实验采用小水体催情、交配、抱卵和越冬，观察荧光标记对中华绒螯蟹繁殖的影响，并按下式计算抱卵率和抱卵量。

抱卵率＝抱卵蟹数/用于观测记录的雌蟹数×100%

抱卵量＝1 g卵子数×卵子总重

结果表明，存活的6 ind雌蟹中有5 ind成功交配和抱卵（图4），抱卵率为83.3%，平均抱卵量30×104egg·ind－1，卵子外观呈深棕色，富有光泽。与未标记中华绒螯蟹小水体繁育实验结果（抱卵率85.0%，平均抱卵量30×104egg· ind－1）比较，抱卵率、平均抱卵量无显著性差异（P＞0.05），表面VIE荧光标记对中华绒螯蟹的发育和繁殖无明显影响。

表1 对照组和标记组生长指标比较Tab.1 G row th over 80 days of the control and tagged E.Sinensis

图3 幼蟹养成后VIE标记的可识别效果（箭头所指为荧光标记部位）Fig.3 Persistence of elastomer of crabs in the field（Arrows indicate the locations of VIE）

图4 VIE标记的抱卵蟹（箭头所指为荧光标记部位）Fig.4 Tagged crab w ith eggs（Arrows indicate the locations of VIE）

3 讨论

本研究首次开展中华绒螯蟹荧光标记应用实验，VIE分别标记在幼蟹不同部位（复眼眼眶、螯掌节和腕节间的关节膜、腹甲和腹部），以期获得最佳标记效果，确定中华绒螯蟹最适标记部位。实验持续8周后各组的即时死亡率、存活率和标记保持率均无显著性差异（P＞0.05），但标记在螯掌节和腕节间的关节膜的一组幼蟹存活率略高于其它标记组，且幼蟹正常蜕壳后该组标记的可视性优于其它3组，这与VIE标记红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）［4］和达乌尔鳇（Husodauricus）［12］所得结论一致：应选择动物透明度相对较高的部位进行标记，由此可见在中华绒螯蟹中荧光标记最佳部位就是螯掌节和腕节间的关节膜。

衡量荧光标记VIE适用性的重要指标是其对水生生物存活和生长发育的影响及其在生物体内的保持率。通常认为影响标记保持率的因素主要是标记的颜色、动物大小和种类以及标记部位等［14－15］。本研究选取可识别性最强的红色荧光标记中华绒螯蟹幼蟹，实验室内养殖的标记幼蟹持续观察8周后的标记保持率为100%，这与ESBEN等［13］用VIE标记褐鳟（Salmo trutta），77 d后的标志保持率为100%、BURICˇ等［5］用VIE标记小龙虾（Orconectes limosus）腹部，70 d后标记保持率也为100%的结果相同。标记螯掌节和腕节间的关节膜的幼蟹放养于室外土池，80 d后养成成蟹其标记保持率仅为72.8%，大大低于陈雷等［4］标记红鳍东方鲀尾柄80 d后标记保持率为93%、罗坤等［6］标记中国明对虾（Fennerpenaeus chinensis）210 d后标志保持率在90%以上。幼蟹养成后标记保持率的降低可能是由于中华绒螯蟹生长过程中蜕壳造成标记破损脱落；也可能是VIE标记随着中华绒螯蟹生长而被包裹迁移至较深的组织中，加之中华绒螯蟹结构特殊，生长过程中外壳不断变硬变厚，致使荧光可识别度降低，造成荧光标记在中华绒螯蟹上应用的保持率低于其它水生动物的相关研究结果。因此，荧光染料应尽可能注射到中华绒螯蟹皮下的肌肉层，以减少荧光标记物在中华绒螯蟹蜕壳过程中的损失；但又不能注射太深，以免降低荧光的体外可识别度。

除标记保持率外，荧光标记应用研究要分析的其它重要指标就是标记对动物生存和生长发育的影响。本研究不但统计分析了VIE标记对中华绒螯蟹存活和生长发育的影响，更进一步检验了荧光标记对中华绒螯蟹繁殖的影响，结果显示：VIE荧光标记对中华绒螯蟹的存活、生长发育及繁殖均无显著性影响，这一结论与国内外相关研究结果相同［6－7，16－17］。VIE荧光标记应用于中华绒螯蟹育种研究和增殖放流具有可行性。

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Evaluation of visible imp lant elastomer tags in Chinesem itten crab Eriocheir Sinensis

LI Jing-jing1，2，3，GENG Xu-yun2，DONG Xue-wang2，WEIJun-li2，SUN Jin-sheng2，3，QIU Gao-feng1
（1.College of Fisheries and Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306；2.Tianjin Diseases
Prevention and Control Center of Aquatic Animals，Tianjin300221；3.College of Life Sciences，Tianjin Normal University 300387）

Chinese mitten crabEriocheir Sinensisis one of the most economically important aquaculture species in China due to its taste and nutritious value.However，the wild population ofE.sinensishas experienced a dramatic decline in the past decades because of overfishing and water pollution.Thus enhancement and releasing ofE.Sinensisis imperative.At present，the yield ofE.Sinensisis almost completely from artificial breeding.Unfortunately，like many other cultured species，the aquaculture performance ofE.Sinensishas declined significantly.In order to evaluate the effects of selective breeding and enhancement and releasing inE.Sinensis，a suitable tag is important.In this study，the use of red visible implant elastomer（VIE）tagging system inE.Sinensiswas examined for tag retention rate，crab mortality，growth，developmentand reproduction.Four tag locations are tested in juvenile crabs kept in laboratory.After 8 weeks，all groups showed the same tag retention rate of100%，and therewas no significant difference（P＞0.05）in survival rates between the control group and label groups.Whether VIE affected the growth and/or development ofE.Sinensiswas evaluated with outdoor cultured crabs.And therewas no significant difference between the control and label crabs（P＞0.05）.The findings of crab breeding experiment taken in small water bodies show that the egg holding rate is 83.3%and the egg amount per crab is 30 millions.These are equal to unlabeled crabs in the same condition.All results suggest that VIE tagging system is useful as individual identification tag in researches of resource survey，breeding and production inE.Sinensis.

Eriocheir Sinensis；visible implant elastomer；survival；retention；growth；reproduction

S 931.5；S 968.25

A

1004－2490（2016）04－0400－06

2015－12－07

天津市水产局科研推广项目（J2013－21）、（J2013－7）；国家科技支撑计划项目（2012BAD26B04）；上海高校水产学一流学科建设项目

李晶晶（1982－），女，河北唐山人，博士研究生，助理研究员，从事水产动物遗传育种方向研究。

E-mail：jingjingli206＠163.com

孙金生，教授，E-mail：jinshsun＠163.com；邱高峰，教授，E-mail：gfqiu＠shou.edu.cn