核桃分心木提取液抑菌效果初探

闫艳华，王 鹏，杨卫民

试验研究

核桃分心木提取液抑菌效果初探

闫艳华，王 鹏，杨卫民*

以核桃分心木为试材，研究其甲醇、乙醇和石油醚提取液的抗菌效能，为核桃的综合开发利用提供科学依据。结果表明，甲醇提取液和乙醇提取液能清楚的观察到抑菌圈，石油醚提取液未观察到抑菌圈；甲醇提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度是3.125%，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度是6.25%，乙醇提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度是6.25%，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度是12.5%。

核桃分心木；分心木提取液；抑菌效果；最低抑菌浓度

核桃(Juglans regia L.)是壳斗目，核桃科，核桃属的一种落叶乔木[1]。吕梁地区栽种核桃历史悠久，目前结果的核桃树面积达5万hm2，全年总产量为1 740万kg，分心木的量为2 000 t。根据吕梁市十二五的规划要求，该市在十二五末要实现种植总量33万hm2，年总产7 874万kg，届时分心木的量也会达到10 000 t左右。实际生活中，核桃分心木大多被丢弃[2]，没有得到充分的利用，如果能够充分开发利用核桃分心木，将会使核桃的价值进一步提升[3-4]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料：核桃分心木取自吕梁本地；大肠杆菌E.coli，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，均为吕梁学院实验室贮藏菌种；甲醇、乙醇、石油醚均采购于上海。

1.2 试验方法

1.2.1 提取液的制备 甲醇提取核桃分心木中的抑菌物质：把经过风干后的核桃分心木捣碎。电子天平称取50 g样品倒进试剂瓶里，再向瓶中加450 mL甲醇(边加边搅拌)，薄膜封口， 25 ℃下放置3 d，注意每天隔一段时间搅拌1次。3 d后把试剂瓶置于恒温水浴锅中回流提取60 min，将所得液体用抽滤泵滤过一次后放到旋转蒸发仪中减压浓缩。将最后的浓缩液放到60 ℃干燥箱中干燥直至有固体颗粒出现，取出并加入甲醇配置成10 mL溶液，贴上标签，置于0～3 ℃冰箱中，贮藏备用[5-6]。乙醇、石油醚提取核桃分心木中的抑菌物质：分别称取50 g样品倒进试剂瓶里，之后向试剂瓶里加450 mL乙醇和石油醚，方法同上。

1.2.2 供试菌种活化 从冰箱中取出保存的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌种， 25 ℃下放置24 h后将这两种供试菌在无菌条件下用接种环接种到试管培养基里面，每种细菌重复接5支；放到37 ℃的恒温培养箱中培养18 h，选择一支长势比较好的菌株作为试验菌种，其余的置0～4 ℃冰箱中冷藏备用。

1.2.3 菌悬液的制备 用接种环挑少许活化菌种放到经过灭菌后的9 mL的0.9%的生理盐水中，摇匀，10倍稀释法稀释，然后将稀释后的每个菌悬液用移液枪吸取1μL至血球计数板上再拿到显微镜下观察并计数，估算出1 mL的含菌量，反复操作直至得到含菌量为(6～7)×104个/mL的菌悬液。

1.2.4 固体平板的制备 牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g，将上述试剂混合倒入蒸馏水至1 000 mL，调节pH到7.3；加热煮沸使药品完全溶解， 121 ℃灭菌30 min。待培养基温度降到55 ℃左右，在无菌条件下倒入经过灭菌且干燥后的培养皿内，每皿约175～180 mL，最后得到相同规格的12个盛有等量培养基的培养皿。

1.2.5 不同浓度各提取液的制备 把上面制成的10 mL各提取液的浓度定为1，然后将其分别连续稀释成6种不同浓度；分别是100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的核桃分心木甲醇提取液、乙醇提取液和石油醚提取液[7]。

1.2.6 含抑菌成分滤纸片的制备 将滤纸制成半径为3 mm的小圆片数个，置于玻璃容器内，灭菌，风干。之后将其分别放到盛有7种浓度(包括对照)的3种不同提取液中浸泡 3 h后贴在烧杯壁上晾干。

1.2.7 抑菌效果的检测 按无菌操作向各培养皿中等量加入0.6 mL两种供试菌的菌悬液，用三角涂布器涂布均匀。滤纸片按规范操作放在不同含菌培养皿中，另取浸泡在甲醇、乙醇及石油醚中的滤纸片做空白对照，分别记作 ck1、ck2、ck3，每个培养皿内放7张滤纸片。置于37 ℃的培养箱里培养24 h，检测是否有抑菌圈出现，如果有抑菌圈就分别量出各抑菌圈的直径[8]。

1.2.8 最低抑菌浓度(MIC)的测定 MIC值即提取液的最低抑菌浓度，是指在培养基中完全没有菌能够存在的各提取液的最低浓度。在该试验中测定各提取液不同浓度的抗菌能力时采取固体平板，用MIC值来表示各提取液不同浓度的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈法测定抑菌效果

2.1.1 核桃分心木甲醇提取液的抑菌效果 由图1可知，核桃分心木甲醇提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这2种供试菌都有抑制作用。较高浓度的提取液表现出较为明显的抑菌圈，表明抑菌能力较好，低浓度的提取液抑制效果较差，高浓度与低浓度之间的抑菌能力差别不是很明显，随着浓度的升高抑制作用差异逐渐增大但变化不太大。对照甲醇的抑菌圈直径为6 mm，为抑菌滤纸片的直径，无抑制作用，说明抑菌效果是分心木的作用，而非甲醇的作用。

图1 不同浓度甲醇提取液抑菌效果

2.1.2 核桃分心木乙醇提取液的抑菌效果 由图2可知，不同浓度乙醇提取液对各种供试菌都有较好的抑制能力，其中对大肠杆菌的抑制能力比对金黄色葡萄球菌强，并且随着提取液浓度的降低，提取液对这两种菌的抑制效果差异逐渐减小。高浓度的提取液能形成明显的抑菌圈，说明抑菌作用显著，而低浓度的提取液未发现清晰的抑菌圈，抑菌作用较差，且高浓度与低浓度的抑菌作用差异显著。对照乙醇的抑菌圈不明显，基本没有抑菌能力，说明抗菌效果来源于分心木。与甲醇提取物相比，此提取物较甲醇提取物抑菌效果要好。

图2 不同浓度乙醇提取液抑菌效果

2.1.3 核桃分心木石油醚提取液的抑菌效果 石油醚提取液未形成明显抑菌圈，表明该提取液对这两供试细菌都没有表现出比较好的抑制效果，浸泡在石油醚中的滤纸片在含有供试菌的各培养基上都没有呈现抑菌圈，该试剂无抑菌作用；和上面两种提取液相比，此提取液的抗菌效能最差。

2.2 各提取液的最低抑菌浓度(MIC)

由图3可知，甲醇和乙醇提取液对这两种菌的最低抑菌浓度不同，而石油醚提取液无抑菌作用。甲醇提取液对大肠杆菌MIC值是3.125%，而对金黄色葡萄球菌MIC值是6.25%;乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的MIC值是12.5%，对大肠杆菌的为6.25%，所以此试验中两种提取液浓度对大肠杆菌的MIC值最低。两种提取液无论是在同浓度下还是不同浓度下对大肠杆菌的抑制作用总是比金黄色葡萄球菌显著。由图3可知，各提取物中两种甲醇提取物的抑菌效果最佳，说明甲醇提取抑菌物的效果最好，乙醇次之，石油醚最差。

图3 各提取液的最低抑菌浓度(MIC)

3 结论与讨论

试验对核桃分心木3种提取液的抑菌作用进行了初步研究，发现核桃分心木的甲醇提取液和乙醇提取液有明显的抑菌效果，但石油醚提取液未检测出抑菌能力，另外核桃分心木甲醇提取液的抑菌能力比乙醇提取液有更为显著的抗菌活性，并且抗菌效能随着提取液浓度的缩小而逐渐衰减；甲醇提取液浓度在6.25%时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种细菌都有抑制能力；而乙醇提取液在12.5%才对两种细菌有抑制能力。甲醇提取液对大肠杆菌的MIC值是3.125%，对金黄色葡萄球菌的MIC值是6.25%，乙醇提取液对大肠杆菌的MIC值是6.25%，而对金黄色葡萄球菌的MIC值是12.5%。

据有关文献记载核桃分心木中存在大量的化学物质，其中包括黄酮、生物碱、有机酸或酚性成分等，比较甲醇提取液、乙醇提取液与石油醚提取液这3种试剂检测出的成分，黄酮类物质和酚性成分能被甲醇、乙醇和石油醚试剂所提取[7，9]，但石油醚却未能检测出抑菌效果，这说明石油醚提取出分心木中的抑菌成分的量很少或提取方法不当，所以没有表现出抑制细菌的作用；而同时黄酮类等酚性物质都能够抑制细菌，所以此次试验检测出的抑菌成分可能是黄酮或酚性物质，这有待今后进一步试验验证。到目前为止，由于缺乏对分心木系统性和综合性的研究，人们对于核桃分心木的抑菌功效还掌握的比较少，所以我们要提取分心木中的化学成分做有关抑菌作用的研究，此次试验是对常见细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)的抑制作用的研究，期望将来有关于抑制常见真菌的研究，以便准确了解其抑菌效果，并进行充分地利用；该试验对于核桃分心木的抗菌效能的研究希望能为核桃分心木的综合利用及探明其药用物质基础与食品天然防腐剂领域中的合理开发利用提供有力的依据，并能够开辟出一条新的途径，最终提高核酸化的综合开发利用价值。

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[3]郑绯,赵庆国,凌海慧，等.分心木化学成分及药理作用研究进展[J].首都医药，2014(16):16-17.

[4]毕肯·阿不得克里木,韩艳春,阿依吐伦·斯马义.核桃分心木化学成分的预试验研究[J].新疆医科大学学报，2010(9):1044-1046.

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[6]王帮武,杨新林,张利刚，等.灵芝酸性组分的提取分离及抑菌活性研究[J].北京理工大学学报，2002(1):125-128.

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[8]Feng He,Ying Yang,Guang Yang,et.al.Studies on antibacterial activity and antibacterial mechanism of a novel polysaccharide from Streptomyces virginia H03[J].Food Control，2010,21(9):1257-1262.

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(山西吕梁学院生命科学系，山西 离石 033000)

Preliminary studies on Antibacterial Activities of Walnut Diaphragm Extracts

Yan Yanhua, Wang Peng, Yang Weimin

(Department of Life Science, Lvliang University, Shanxi Lishi 033000)

This experiment did research on the antibacterial efficiency of methanol, ethanol and petroleum ether extractive of Semen Juglandis, which provided factual basis for further comprehensive production and development of Semen Juglandis. The result showed that methanol extractive and ethanol extractive can observe the bacteriostatic circle clearly , while petroleum and extractive can not.The minimal inhibitory concentrations (MIC) of methanol and ethanol extractive for E.coli are 3.125% and 6.25%， and Staphylococcus aureus are 6.25% and 12.5% respectively.

Semen Juglandis; extractive;antibacterial activity; minimal inhibitory concentration

2015-11-10

吕梁学院自然科学校内基金(ZRXN201406)；吕梁学院自然科学青年基金(ZRQN201401)

闫艳华(1985-)，女，山西离石人，大学教师，硕士研究生，主要从事植物生长与发育研究工作。电话：13835849931，E-mail：19852008@163.com

1005-345X(2016)03-0001-04

S664.1

A

*通讯作者(yangweimin0318@163.com)