乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅的毒性测定

夏晓华， 董 慧， 李会娜， 夏晓培， 常重杰*

(1.河南师范大学 生命科学学院， 河南 新乡 453007； 2.河南省汝州市质量技术监督检验测试中心， 河南 汝州 467500)

乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅的毒性测定

夏晓华1， 董 慧1， 李会娜2， 夏晓培1， 常重杰1*

(1.河南师范大学 生命科学学院， 河南 新乡 453007； 2.河南省汝州市质量技术监督检验测试中心， 河南 汝州 467500)

为探明除草剂乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)对水生生物的毒性，以大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)为受试对象，进行乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅的急性毒性、生理毒性和DNA损伤试验。结果表明：随着染毒浓度增加和时间的延长，大鳞副泥鳅的死亡率升高，安全浓度为8.40 mg/L，根据中国《化学农药环境安全评价试验准则》，乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅为低毒。乙氧氟草醚低浓度(8.00 mg/L，10.50 mg/L，13.00 mg/L)作用下，大鳞副泥鳅肝脏谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性明显升高；高浓度(15.50 mg/L)作用下酶活性在染毒2 d、4 d时呈上升趋势，但在6 d时急速下降。15.50 mg/L组与空白对照组相比，大鳞副泥鳅肝细胞的彗尾DNA百分含量、彗星尾长和Olive尾矩明显增加，肝细胞受到明显损伤。

乙氧氟草醚； 大鳞副泥鳅； 谷丙转氨酶； 谷草转氨酶； 单细胞凝胶电泳

乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)为美国罗门哈斯公司(现陶氏公司)1975年开发成功的二苯醚类除草剂，其制剂为24%乙氧氟草醚EC，商品名称果尔。先后在美国、巴西、墨西哥等国取得登记，并于20世纪80年代在中国登记，登记作物为水稻[1]。乙氧氟草醚是一种触杀型除草剂，在有光的情况下发挥除草作用[2]。随着化学除草剂在农业生产上的广泛应用，其对环境造成的污染也越来越严重。长期大量化学除草剂的应用带来的残毒和环境污染，直接危害到人畜健康，影响农业的可持续发展[3]。农业生产中的不合理使用，雨水冲刷、地表径流及农药厂污水的肆意排放等使乙氧氟草醚进入河流、湖泊、海洋等水生生态系统，从而对水生生物的生存以及水生生态系统的稳定与平衡造成威胁。邹积鑫等[4]研究了乙氧氟草醚的同类药剂乙羧氟草醚对斑马鱼的急性毒性和生物富集性，结果表明，乙羧氟草醚对斑马鱼8 d的生物富集系数很低，在鱼体内的富集量较少，而且其在水中的溶解性较差(溶解度仅0.6 mg/L)，降解较快，因此一般不会对水生生物产生长期的毒害和富集作用；但对鱼类的急性毒性较高，因此在施用时应合理控制剂量，尽量减少对水生生物的影响。但到目前为止，国内外关于乙氧氟草醚对水生生物的遗传毒性研究鲜见报道。为此，笔者以大鳞副泥鳅为材料，通过单细胞凝胶电泳等技术研究乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅的急性毒性、生理毒性和DNA损伤，以期为安全使用除草剂，保护渔业资源，维护生态平衡，保障人体健康提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大鳞副泥鳅350尾，采自新乡市海鸿农贸市场，发育状况良好，体长12～15 cm。用曝气3 d的自来水在室内暂养1周，水温(20±2)℃，溶解氧5～6 mg/L，pH 6.9～7.2。隔天换水1次，染毒时挑选健康无病、规格一致的个体进行试验。试验前1 d停止喂食，进行饥饿处理，试验期间不投喂饲料。乙氧氟草醚制剂购自新乡市东海农资市场(上海惠光化学有限公司，有效成分含量23.5%)。

1.2 急性毒性试验

通过预试验，找出乙氧氟草醚使大鳞副泥鳅在96 h内全部存活的最高染毒浓度、全部死亡的最低染毒浓度，确定试验浓度区间。正式试验按等比浓度将乙氧氟草醚配制为18.75 mg/L、23.44 mg/L、29.30 mg/L、36.62 mg/L和45.78 mg/L 5个试验组和1个空白对照组，每组均投放10尾健康大鳞副泥鳅，重复3次。每24 h更换1次等体积等浓度的乙氧氟草醚稀释液，前12 h连续观察，并及时清除死亡个体，以免影响其他个体的生存。观察记录大鳞副泥鳅在24 h、48 h、72 h及96 h的死亡数量，并记录中毒症状。

采用改进寇氏法(Karber)[5-6]计算乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅的半数致死质量浓度(LC50)和安全浓度(SC)。

LgLC50=Xm-i(∑p-0.5)

SC=LC50(24h)×0.3/[(LC50(24h)/LC50(48h))3

式中，Xm为死亡组最大剂量的对数，i为相邻组浓度对数之差，∑p为各组死亡率的总和。

1.3 生理毒性试验

在急性毒性试验基础上，在安全浓度和最大零致死浓度之间等差设置8.00 mg/L、10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L 4个处理组和1个空白对照组，每组均随机投放20尾健康大鳞副泥鳅，重复3次。每隔24 h各组分别更换1次等体积(2 L)等浓度的乙氧氟草醚稀释液。分别于2 d、4 d和6 d每组随机取3尾大鳞副泥鳅取出肝脏。肝脏匀浆的制备和谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活力的测定均按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行。

1.4 肝细胞的DNA损伤试验

单细胞凝胶电泳(SCGE)检测大鳞副泥鳅肝细胞DNA损伤。试验设置同生理毒性试验，分别2 d、4 d和6 d每个浓度取3尾大鳞副泥鳅制备肝细胞悬液，试验步骤参照陈忻等[7-8]的方法进行。大鳞副泥鳅肝细胞的单细胞凝胶电泳运用CASP彗星图像分析软件进行分析，得出彗尾DNA百分含量(Tail DNA%)、彗尾长度(Tail length，TL)、Olive尾矩(Olive tail moment，OTM) 3项指标数据，导入统计分析软件Spss16.0进行统计分析。

1.5 统计分析

试验数据用软件Excel 2003进行整理，用软件Spss 16.0软件进行单因素方差分析，结果用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 急性毒性

大鳞副泥鳅刚染毒时表现为急剧游动，四处乱窜，尤其在高浓度组中表现更为明显，上蹿下跳、打转、翻白，片刻后趋于平静，伏于水底，胸鳍张开。然后反应迟钝，身体弯曲，游动缓慢，逐渐丧失平衡能力，翻白肚等现象，死亡时身体僵直，脊椎略弯曲成弓形。从表1看出，随乙氧氟草醚浓度的增加死亡率不断升高。经计算，乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅24 h、48 h、72 h和96 h的半数致死质量浓度分别为41.87 mg/L、36.62 mg/L、29.96 mg/L和25.62 mg/L，安全浓度为8.40 mg/L。

表1 乙氧氟草醚各浓度组大鳞副泥鳅不同 染毒时间的死亡率

Table 1 MortalityofP.dabryanusexposed to different oxyfluorfen groups at different times

乙氧氟草醚浓度/(mg/L)Oxyfluorfenconcentration死亡率/%Mortality24h48h72h96h0．00000018．750003．3323．4403．3320．0026．6729．306．676．6736．6780．0036．6213．3363．3386．67100．0045．7870．0076．6796．67100．00

2.2 GPT和GOT活性

从表2看出，从相同时间不同质量浓度来看，染毒2 d、4 d的肝细胞GPT、GOT活力均随乙氧氟草醚浓度的增加而升高，且4 d时13.00 mg/L、15.50 mg/L浓度组与对照组比，GPT活力显著升高，10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L浓度组GOT活力极显著升高。6 d时除乙氧氟草醚15.50 mg/L浓度组外，其余组随乙氧氟草醚浓度增加GPT和GOT活力上升，在8.00 mg/L和10.50 mg/L时GPT活力显著升高，13.00 mg/L时GPT活力极显著升高；GOT活力在8.00 mg/L时显著升高，10.50 mg/L和13.00 mg/L时极显著升高。

2.3 肝细胞DNA损伤

荧光显微镜400倍镜检可见对照组大鳞副泥鳅肝细胞的细胞核均呈圆球形，彗星头部DNA致密且集中；随乙氧氟草醚浓度增加细胞核均有拖尾呈彗星样，细胞核头部逐渐缩小，拖尾程度逐渐增加，散发(图示)。

从表3看出，在相同染毒时间，除乙氧氟草醚浓度15.50 mg/L染毒6 d外，其余随乙氧氟草醚浓度增加彗尾DNA百分含量、Olive尾距和尾长逐渐增加。在同一浓度组，随处理时间的延长，肝细胞凝胶电泳彗尾DNA百分含量、Olive尾距和尾长增加。

表2 乙氧氟草醚各浓度组大鳞副泥鳅不同染毒时间肝细胞的GPT及GOT活性

Table 2 GPT and GOT activity ofP.dabryanusliver cells treated with different concentrations of oxyfluorfen and different explose time

乙氧氟草醚浓度/(mg/L)Oxyfluorfenconcentration2dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)4dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)6dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)0．003．37±0．242．16±2．003．21±0．992．30±1．573．46±0．792．24±1．678．005．13±4．433．04±2．7919．30±10．118．03±0．4322．24±4．19∗12．77±3．41∗10．506．97±2．063．44±3．6921．39±7．7212．01±3．42∗∗28．39±11．65∗17．11±1．83∗∗13．009．66±0．174．36±1．8130．76±11．85∗12．89±0．41∗∗32．59±9．80∗∗16．45±5．21∗∗15．5011．04±6．425．12±2．9930．98±7．62∗14．55±3．50∗∗15．00±1．547．95±3．89

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)(下同)。

Note：Values followed by * and ** mean significant difference at 0.05 and 0.01 level， respectively. The same below.

注：CK为空白对照组，A、B、C和D分别表示乙氧氟草醚浓度为8.00 mg/L、10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L。

Table 3 DNA damage ofP.dabryanusliver cells treated with different concentrations of oxyfluorfen and different expose time

时间Time浓度/(mg/L)Concentration彗尾DNA/%TailDNA尾长TaillengthOlive尾矩Olivetailmoment对照(CK)0．000．16±0．0917．50±9．190．17±0．072d8．000．71±0．6414．67±5．030．71±0．0510．501．06±0．2117．67±5．511．19±0．2413．002．74±0．22∗43．67±11．592．95±0．3815．504．11±0．24∗∗63．67±9．074．95±0．54∗∗4d8．001．52±0．3622．00±7．071．66±0．5610．502．20±0．0125．67±7．772．12±0．2613．003．13±0．10∗51．67±15．373．42±0．59∗15．505．41±0．18∗∗66．67±18．775．98±0．71∗∗6d8．006．93±0．44∗∗76．00±23．30∗8．76±1．78∗∗10．5011．55±0．62∗∗116．67±34．02∗∗15．79±3．00∗∗13．0036．10±6．74∗∗229．67±64．84∗∗72．69±6．17∗∗15．5015．13±1．08∗∗154．67±45．71∗∗29．34±1．54∗∗

3 结论与讨论

3.1 乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅的安全性

根据中国《化学农药环境安全评价试验准则》[9]，农药对鱼类96 h的LC50≤0.1 mg/L时该农药对鱼类属于剧毒，当0.1 mg/L<96 hLC50≤1.0 mg/L时属于高毒，当1.0 mg/L<96 hLC50≤10 mg/L时属于中毒，当96 hLC50>10 mg/L时属于低毒。试验结果表明，乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅的96 hLC50为25.62 mg/L，安全浓度为8.40 mg/L，说明乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅为低毒。但随着染毒时间的延长大鳞副泥鳅死亡率升高，说明乙氧氟草醚对水生生物有毒害作用。因此，在使用该除草剂时一定要适量施用，注意安全，避免污染水源、破坏环境，以免对水生生物造成危害。

3.2 乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅GPT和GOT活性的影响

肝脏是营养物质消化的主要腺体，也是尿素合成的主要场所，具有解毒功能。谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)是肝脏内活性最高的2种转氨酶，其活性变化与肝细胞的炎症、变性和坏死等密切相关，即使非常小的剂量也会对肝功能造成损伤[10]。其中，GPT被推荐为肝功能损害最敏感的检测指标，其活性变化亦是反映肝细胞受损的主要指标。GPT和GOT的活性提高能加快尿素生成，减少氨基酸代谢产物对机体的毒害[11]。试验结果表明，乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅GPT和GOT的活性在染毒2 d、4 d时明显高于对照组，说明短时间乙氧氟草醚处理可诱导2种酶活性的提高，加强毒物的排出；而染毒6 d时这2种酶的活力虽呈上升趋势，但15.50 mg/L组的酶活力明显低于13.00 mg/L组。说明，大鳞副泥鳅肝细胞长期处于不良状态下，功能开始下降[12]。

3.3 乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅肝细胞的DNA损伤

单细胞凝胶电泳实验是检查细胞遗传物质损伤的一种方法。彗尾DNA百分含量、尾长和Olive尾距是彗星实验中反映细胞DNA所受损伤的1个重要指标。彗尾DNA百分含量和Olive尾距越大，尾长越长说明细胞受到的DNA损伤越严重。试验结果表明，乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅肝细胞的DNA损伤，在染毒2 d、4 d时低浓度组(8.00 mg/L,10.50 mg/L)大鳞副泥鳅肝细胞凝胶电泳的彗尾DNA百分含量、尾长和Olive尾距与对照组相比无显著差异，而15.50 mg/L处理组的明显升高，表明较高剂量的乙氧氟草醚对大鳞副泥鳅肝细胞DNA造成了损伤。在染毒6 d时，15.50 mg/L组的彗尾DNA百分含量、尾长和Olive尾距较13.00 mg/L组有所下降，可能是由于DNA的损伤过于严重，以至于电泳时造成DNA片段丢失，因此导致测量值下降[13-14]。

[1] 吴志凤.乙氧氟草醚的应用前景与使用技术[J].杂草科学，2004(4):12-14.

[2] 范莲生.二苯醚类除草剂乙氧氟草醚[J].农药，2000，39(2):35-37.

[3] 强 胜，陈世国.环保与生物除草技术[J].国际学术动态，2009(5):26-28.

[4] 邹积鑫，何雄奎，陶传江，等乙羧氟草醚对斑马鱼的急性毒性和生物富集性研究[J]农药学学报，2006，8(4):375-378.

[5] 张毓琪，陈叙龙.环境生物毒理学[M].天津:天津大学出版社，1993:257-258.

[6] 惠秀娟.环境毒理学[M].北京:化学工业出版社，2003:270-271.

[7] 陈 忻，西田浩志，小西徹也.单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复[J].西安交通大学学报，2007，28(1):25-26.

[8] 曹 毅，陈 瑞，王仲文，等.彗星分析技术检测辐射和化学物质诱导的DNA损伤[J].癌变·畸变·突变，2003，15(3):144-146.

[9] 国家环保局.化学农药环境安全性评价试验准则[J].农药科学与管理，1990(2):1-5.

[10] 林 立，曾晓立，张 璟.丙溴磷对家兔肝组织脂质过氧化及肝功能的影响[J].中国临床康复，2004，8(21):4380-4381.

[11] 赵 杰，谷子林，崔青曼，等.“克白克”对中国对虾体内琥珀酸脱氢酶、磷酸甘油三酯和谷草转氨酶活性的影响[J].中国饲料，2002(3):31-32.

[12] 汪开毓，耿 毅，钟妮娜.鱼类应激性出血症的病理学研究[J].淡水渔业，2000，30(11):28-31.

[13] Risso-deFavemey C，Devaux A，Iafaurie M，et a1.Cadmiuminduces apoptosis and genotoxicity in rainbow trout hepatocytes through generation of reactive oxygene species[J].Aquat Toxicol，2001，53:65-76.

[14] Vanzella T P，Martinez C B R，C'olus I M S.Genotoxic and mutagenic effects of diesel oil water soluble fraction on a neotropical fish species[J].Mutation Research，2007，631(1):36-43.

(责任编辑： 冯 卫)

Toxic Determination of Oxyfluorfen onParamisgurnusdabryanus

XIA Xiaohua1， DONG Hui1， LI Huina2， XIA Xiaopei1， CHANG Zhongjie1*

(1.CollegeofLifeSciences，HenanNormalUniversity，Xinxiang,Henan453007; 2.JnspectionandTestingCenters,QualityandtechnicalsupervisionofRuzhou,Ruzhou,Henan467500,China)

In order to assess the toxicity of herbicide oxyfluorfen to aquatic organisms， regardingP.dabryanusas the experimental object， acute toxicity， physiological toxicity and DNA damage experiment were employed to study oxyfluorfen’s effect onP.dabryanus. Results:P.dabryanusmortality increased with the concentration increasing and the extension of time. The activities of GPT and GOT inP.dabryanusliver cells were induced by the lower concentration (8.00 mg/L, 10.50 mg/L, 13.00 mg/L) treatments group. The action of enzyme activity on 2 d,4 d rises，but it fell sharply in the 6 d under the high concentration (15.50 mg/L) of the oxyfluorfen. The liver cells’ DNA damage were checked by single cell gel electrophoresis technique (SCGE). Compared with the control group,treatment group’s (15.50 mg/L) three indexes,tail DNA content,the comet tail length and olive tail moment increased significantly(P<0.05), liver cell was obviously damaged.

oxyfluorfen；Paramisgurnusdabryanus； GPT； GOT； single cell gel electrophoresis(SCGE)

2015-06-30； 2015-12-17修回

国家自然科学基金项目“两种泥鳅DMRT1基因不同选择性剪接体的结构、功能及调控机制研究”(31200923)；河南省教育厅科学技术研究重点项目“大鳞副泥鳅DMRT1基因不同选择性剪接体的表达模式分析”(12B180011)；河南师范大学引进人才科研项目“泥鳅DMRT1基因不同剪接体的克隆和时空表达模式分析”(01046500109)

夏晓华(1982-)，女，副教授，博士，硕士生导师，从事分子细胞遗传学研究。E-mail:xxhlpf@163.com

*通迅作者：常重杰(1965-)，男，教授，博士，博士生导师，从事分子细胞遗传学研究。E-mail:changzhongjie@tom.com

1001-3601(2016)01-0030-0113-04

S948

A