昆虫温度耐受性评价方法的研究进展

李鸿波， 何永福

(贵州省植物保护研究所， 贵州 贵阳 550006)

昆虫温度耐受性评价方法的研究进展

李鸿波， 何永福*

(贵州省植物保护研究所， 贵州 贵阳 550006)

昆虫属变温动物，对环境温度具有很强的依赖性。昆虫对温度胁迫的适应能力直接决定其种群动态和地理分布。为科学评价昆虫的温度耐受性，对已报道的有关昆虫温度耐受性评价方法进行全面总结，并对其优缺点进行评价。

温度耐受性； 评价方法； 昆虫

昆虫是变温动物，其生命活动受到温度(高温和低温)、湿度、光照(辐射)、重金属、食物、寄生及捕食等诸多生物和非生物因子的影响。其中，温度是最基础的环境因子之一。在时间和空间范围，其直接和间接地决定昆虫的生态学和进化等[1]。如，温度影响昆虫的免疫功能、交配、繁殖以及生长[2]，同时，温度也是造成昆虫死亡的重要因子，昆虫对温度的适应能力决定其分布和种群动态[3]。

在自然界，环境温度是多变的，这对昆虫的繁衍构成极大威胁。昆虫为了能适应环境，必须具备一定的耐受能力，否则，将面临灭亡。全球气候变化除包括极端高温外，还包括极端低温，而且二者出现的频率增多。因而极端温度对昆虫种群的影响，昆虫应对极端温度的行为进化与适应成为生态学与进化生物学领域研究的核心。昆虫温度耐受性的研究已有数十年的历史，评价方法也有多种，所得的结果也不尽相同。

总体而言，这些评价方式可以分为2类：一类是将昆虫直接暴露胁迫温度下(急剧式)，二是通过缓慢的升温或者降温暴露到胁迫温度下(斜坡式)[4-6]。为科学地评价昆虫的温度耐受性，作者对其评价方法进行了全面的总结。

1 昆虫耐寒性的评价方法

1.1 昆虫过冷却点的测定

图1 测定昆虫过冷却点的简易装置

尽管多位学者对测定方法进行了改进，但仍然存在一些缺点。首先，无法测定微小昆虫(如，西花蓟马，烟粉虱等)的过冷却点。因此，在今后的研究中需对探头进行改进，提高其灵敏度，方可满足一些小型昆虫过冷却点的测定。其次，要尽量联合其他指标评价昆虫耐寒性的强弱。

1.2 半致死温度或半致死时间

由于许多昆虫属于避冻型，常常在高于过冷却点的温度死亡，因而过冷却点不能作为衡量耐寒性的指标，至少不能完全代表昆虫的耐寒性。因此，昆虫的耐寒性主要取决于在低温下的存活率。在昆虫毒理学中常采用LC50表示杀虫剂或化学物质对昆虫的毒力。类似，目前主要采用半致死温度(Ltem50)或半致死时间(Ltime50)评价昆虫耐寒性。Ltem50主要指在特定时间下，导致昆虫50%个体死亡所对应的温度；而Ltime50是指在特定低温条件下，导致昆虫50%个体死亡所对应的时间。通常是将供测试的昆虫置于5～7个低温下，所设置的温度范围和温度间隔因昆虫的种类而不同。所设置的温度不能太高也不能太低。温度过高昆虫全部存活，而温度过低又导致个体全部死亡，无法估算出致死中温。总的原则是最高温度下的死亡率为0%～10%，而最低温度下的死亡率为90%～100%，保证中间温度的死亡率为50%～60%。同样，将供试昆虫暴露在特定低温下不同的时间时，保证最短时间和最长时间所对应的死亡率分别在0%～10%和90%～100%就能计算出Ltime50。

通常情况下，要想得到理想的Ltem50或Ltime50需要进行预备试验。Ltem50或Ltime50可以利用逻辑斯蒂曲线进行拟合求得，其拟合曲线一般呈S型[13]。公式为y=k/(1+ea+bx)。式中，y为存活率，x为温度，k、a、b为相关估计系数。人们利用该模型对飞蝗[14]、斑潜蝇[15]、红火蚁[16]、方翅网蝽[11]和苹浅褐卷蛾[17]的Ltem50进行估算。Jing等[14]研究发现，飞蝗在不同季节的抗寒性具有显著差异，夏季、秋季和冬后在低温下暴露6 h的Ltem50依次为-24.4℃、-28.6℃和-11.6℃，说明，飞蝗抗寒性高低依次为秋季>夏季>冬后[11]。在实际研究中，Ltem50或Ltime50与气候数据结合，可以大致判断某种害虫的分布范围和在某一地区的越冬情况；同时在室内也常作为利用低温杀灭仓储害虫的依据。因此，Ltem50或Ltime50已成为评价抗寒性最常用的指标。

1.3 伤害低温总和

在低温条件下暴露时间也是影响昆虫存活率不可忽略的因素。在评价昆虫的耐寒性时，暴露温度常常是作为强度因子，而暴露时间则是数量因子。昆虫耐寒性同时受到暴露温度和暴露时间的交互影响。为了将2个因子同时用于评价昆虫的耐寒性，Nedve提出“伤害低温总和(Sum of injurious temperature, SIT) ”的概念，其是指导致有效冷伤害的时间和有效低温的共同作用，即所获低温胁迫的累积剂量。利用三维结构图(图2A)能很好地反映存活率、暴露低温和暴露时间三者之间的关系[18]。

从图2B可知，温度和伪苹果蠹的存活率呈正相关，即温度越低导致存活率越低；而伪苹果蠹的存活率与暴露时间呈负相关，即在一定低温下暴露时间的增加导致该害虫存活率降低。此三者之间的关系采用数学模型可表示为

注：A，低温; B，高温。

Note:A, low temperature; B, high temperature.

图2 不同温度和时间下伪苹果蠹蛾的存活率

Fig.2 Mean survival ofT.haumatotibialeucotretaat different test temperatures for different experimental durations

式中，t表示时间，T表示温度；S(t,T)为昆虫种群在时间t和温度T条件下的死亡率(%)，a, b, c为常数。利用该模型可计算昆虫在恒定低温下的存活率，但昆虫在自然界所经历的环境温度是多变的，因此，该模型存在2个缺点： 1) 不能用于估算昆虫在变温下的存活率； 2) 未考虑影响昆虫抗寒性的其他因素。

为此，需要建立一个更加全面的模型评价昆虫的耐寒性[3]。钟景辉[19]对上述公式进行改进，得公式：

S(t,T)=e(a+b∑tiTi)/[ 1+(a+b∑tiTi)]

式中，S为死亡率，可通过试验测定；ti为特定低温暴露时间，其单位可根据试验具体情况选择天、小时或分钟等时间单元；Ti为特定低温暴露温度，单位为℃；i为变化温度处理数，i=1，2，3，…；∑tiTi为变化低温处理的低温累积，可以通过各温度及其暴露的时间计算；a、b为常数，其中-a/b的生物学意义为造成昆虫50%个体死亡时的低温累积，即“半致死低温累积”(Semi-lethal sum of chill injurious temperature, LSCIT50)，以此指标比较耐寒性的强弱。通过上述公式计算松突圆蚧成虫春夏秋冬四季的LSCIT50分别为-181.62、-56.54、-175.87和-219.38，说明该害虫的耐寒性具有季节性差异，其抗寒性强弱依次为冬季>春季>秋季>夏季。

与前人的方法相比，改进后的方程既充分考虑了低温暴露强度和低温暴露时间2个因素的交互影响，又克服了前人研究不能评价变化低温暴露试验中昆虫耐寒性的缺点，但该模型没有考虑到对昆虫造成冷伤害的低温累积上限(Upper limited sum of chill injurious temperature, ULSCIT)。因此，该方法只适用于不同研究对象耐寒性的比较或在已知试验设置的低温累积必然造成冷伤害的条件下昆虫耐寒性的评价[19]。

1.4 冷伤害昏迷恢复时间

冷伤害昏迷恢复时间(Chill coma recovery time)作为衡量昆虫耐寒性的指标[1,20-22]被广泛接受。其定义是经低温处理的昆虫在较高的温度环境中从冷伤害昏迷中苏醒到正常活动状态所需的时间。Marais E等[22]收集Drosophilamelanogaster和D.ananassae2种果蝇成虫于玻璃瓶中，置于-5℃的水浴中30～45 min后，将成虫和若虫倒入培养皿中，迅速放入20℃的恒温培养箱中让其恢复。通过培养箱的玻璃门记录果蝇从水浴中取出到开始能正常爬行的时间，即为冷伤害昏迷恢复时间。该研究发现，D.melanogaster在20℃下的恢复时间为8 min，而D.ananassae的恢复时间约为25 min，说明，D.melanogaster的抗寒性强于D.ananassae。该方法的优点是操作比较简单，但缺点是比较费时。

2 昆虫耐热性的评价方法

2.1 Ltem50和Ltime50

昆虫耐热性的Ltem50和Ltime50测定方法同抗寒性。

2.2 半致死高温累积

半致死高温累积(Semi-lethal sum of heat injurious temperature, LSHIT50)的评价方法同LSCIT50。由于该模型没有考虑到对昆虫造成热伤害的高温累积下限(Lower limited sum of heat injurious temperature, LLSHIT)，因此只适用于不同研究对象耐热性的比较或在已知试验设置的高温累积必然造成热伤害的条件下昆虫耐热性的评价。同样，昆虫的耐热性受到暴露温度和暴露时间交互作用的影响。存活率、暴露高温和暴露时间三者之间的关系可以利用三维结构图(图2B)表示[18]。在高温下，昆虫的存活率与暴露温度和暴露时间都呈负相关，即暴露温度越高，暴露时间越长，昆虫的存活率越低。

2.3 临界最高温度

临界最高温度(Critical temperature maximum, CTmax)被用于定义脊椎和无脊椎动物的耐热性已有60年的历史。临界最高温度的早期定义是指运动器官受到损伤，昆虫丧失逃避能力时的温度[23]。Lutterschmidt等[24]认为，CTmax是一个很好的用于评价生物高温生理和散热能力的标准。

传统上，用于定义CTmax的生理状态是不断变化的，包括失去翻正反应(loss of righting response)，肌肉痉挛的开始(onset of muscular spasms)，热瘫痪(heat paralysis)，热昏迷(heat coma)，甚至热击倒(knockdown)[25]。Cowles R B等[23]将CTmax定义为运动器官和体壁透气功能的正常运作上限温度用于果蝇耐热性研究。前人的研究表明，CTmax主要是通过测量上述涉及的生理状态发生时昆虫体壁的温度进行估算。随着研究的发展，研究者常采用更加客观的方法，即用呼吸运动热量极限法和检测活动能力法相结合的方式估计CTmax[26-27]。呼吸运动热量极限法适用于测量具有非随意肌物种的CTmax，以体壁通气功能的丧失表示；而活动能力监测法则适宜具有随意肌物种CTmax的检测，以运动能力的丧失表示。该方法的优点是既适于对非随意肌也适于对随意肌物种CTmax的测定。体壁通气功能的丧失主要通过二氧化碳输出模式的改变判断。以果蝇成虫为例，高温驯化品系的CTmax为2.4 μL/(h·mg)，而对照品系的CTmax为1.9 μL/(h·mg)，说明，经高温驯化后，果蝇的耐寒性得到加强[27]。总体而言，该方法的优点是能真实地反映昆虫的耐热性，缺点是仪器设备的价格十分昂贵。

2.4 击倒温度和击倒时间

热击倒温度(Knock down temperature)是指生物在加热过程中倒下那一刻所对应的温度，而热击倒时间(Knock down time)是指生物从暴露在高温下到击倒所需的时间。一般的操作方法是将昆虫装在透明的容器内，置于加热容器中，从室温开始以一定的速率(如0.01℃/min)开始加热。在加热的初始阶段，昆虫会异常的兴奋。随温度的继续升高，昆虫的活动能力逐渐减弱。达昆虫瞬时倒下那一刻的温度就称之为击倒温度。而击倒时间的测定方法是，从室温开始以一定速率开始加热，当达某一温度后，在此温度下持续保持一段时间，直到昆虫倒下那一刻，记录所经历的时间，即为热击倒时间。目前，许多学者运用该指标评价模式昆虫果蝇和一些农业害虫的耐热性[28-30]。余昊[31]研究发现，温室白粉虱在45℃下的击倒时间约为30 min，而B型烟粉虱的击倒时间则接近45 min，说明B型烟粉虱的耐热性要显著强于温室白粉虱。

3 结论与讨论

全球气候变化已是一个不争的事实，而昆虫如何适应气候变化则是未来生态学领域研究的一个热门话题。因此，在评价昆虫的温度耐受性时，方法的选择尤为重要。斜坡式的变温被认为更接近昆虫在自然条件下所经历的温度变化，而急剧的温度变化是昆虫在自然界不常遇到的。当然，斜坡式的评价方式也存在对昆虫的耐受性估计不足的问题。如，昆虫在缓慢的温度变化过程中遭遇饥饿和干燥从而影响最终结果的准确性；同时，由于该混淆效应影响昆虫温度耐受性的变化和遗传特性。然而，人们认为斜坡式的评价方式更能客观地反映生态学事实[4]，尽管其他胁迫因子的混淆效应会影响昆虫在自然界的温度耐受性极限。此外，在斜坡式的评价方法中，昆虫所遭遇的干燥和饥饿胁迫所带来的影响微小，除非评价过程中涉及的是小动物和持续的时间较长。因此，在进行比较研究和理解潜在的混淆效应时，方法的选择十分重要。基于斜坡式的温度耐受性评价仍然是理解和预测昆虫对气候变化响应的重要方法。

[1] Hoffmann A A,Sørensen J G,Loeschcke V.Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches[J].Journal of Thermal Biology,2003,28:175-216.

[2] 刘丽辉，张 帆，吴珍泉.温度对西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)生长发育和存活率的影响[J].生态学报,2008,28(10):4891-4895.

[3] 景晓红，康 乐.昆虫耐寒性的测定与评价方法[J].昆虫知识,2004,40(1)：7-10.

[4] Terblanche J S,Hoffmann A A,Mitchell K A,et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures[J].Journal of Experimental Biology,2011,214:3713-3725.

[5] Nguyen C,Bahar M H,Baker G,et al.Thermal tolerance limits of diamondback moth in ramping and plunging assays[J].PLoS ONE,2014,9(1):e87535.

[6] Bahar M H,Hegedus D,Soroka J,et al.Survival and Hsp70 gene expression inPlutellaxylostellaand its larval parasitoid Diadegma insulare varied between slowly ramping and abrupt extreme temperature regimes[J].PLoS ONE,2013,8(9):e73901.

[7] 乌莎廷斯卡姬.昆虫耐寒性原理[M].张淑德,巫国瑞，译.北京:科学出版社,1960.

[8] 鞠瑞亭,杜予州.昆虫过冷却点的测定及抗寒机制研究概述[J].武夷科学,2002(18):252-257.

[9] 秦玉川,杨建才.一种便携式测定昆虫过冷却点的方法[J].昆虫知识,2000,47(4):236-238.

[10] 吕龙石，丛明亮，孟艳玲.一种昆虫过冷却点的简易测定装置[J].昆虫知识,2010,47(6):1257-1260.

[11] Ju R T,Wang F,Xiao Y Y,et al.Supercooling capacity and cold hardiness of the adults of the Sycamore Lace Bug,Corythuchaciliate(Hemiptera: Tingidae)[J].CryoLetters,2010,31(6):445-453.

[12] Zhao Y X,Kang L.Cold tolerance of the leafminerLiriomyzasativae(Diptera:Agromyzidae)[J].Journal of Applied Entomology,2000,124:185-189.

[13] 徐 康，夏宜平，徐碧玉，等.以电导法配合Logistic方程确定茶梅‘小玫瑰’的抗寒性[J].园艺学,2005,32(1):148-150.

[14] Jing X H,Kang L.Seasonal changes in the cold tolerance of eggs of the migratory locust,LocustamigratoriaL.(Orthoptera:Acrididae).Environmental Entomology,2004,33(2):113-118.

[15] Chen B,Kang L.Cold hardiness and supercooling capacity in the pea leafminerLiriomyzahuidobrensis. Cryoletters,2002,23(3):173-182.

[16] 许益镌，陆永跃，黄 俊，等.红火蚁自然种群耐寒性的研究[J].昆虫学报,2009,52(9):974-983.

[17] Bürgi L P,Mills N J.Cold tolerance of the overwintering larval instars of light brown apple mothEpiphyaspostvittana[J].Journal of Insect Physiology,2010,56:1645-1650.

[18] Nedved O,Lavy D,Verhoef H A. Modelling the time-temperature relationship in cold injury and effect of high-temperature interruptions on survival in a chill-sensitive collembolan. Functional Ecology,1998,12(5):816-824

[19] Boardman L,S rensen J G,Terblanche J S.Physiological responses to fluctuating thermal and hydration regimes in the chill susceptible insect,Thaumatotibialeucotreta[J].Journal of Insect Physiology,2013,59(8):781-94.

[20] 钟景辉.松突圆蚧及其天敌花角蚜小蜂对极端温度的耐受性[D].福州：福建农林大学,2009.

[21] Gibert P,Moreteau B,Petavy G,et al.Chill-coma tolerance, a major climatic adaptation amongDrosophilaspecies[J].Evolution,2001,55:1063-1068.

[22] Marais E,Chown S L.Beneficial acclimation and the bogert effect[J].Ecological Letters,2008,11:1027-1036.

[23] Cowles R B,Bogert C M.A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles[J].Bulletin of the American Museum of Natural History,1994,83:261-296.

[24] Lutterschmidt W I,Hutchison V H.The critical thermal maximum: history and critique[J].Canadian Journal of Zoology,1997,75:1561-1574.

[25] Berrigan D,Hoffmann A A.Correlations between measures of heat resistance and acclimation in two species ofDrosophilaand their hybrids[J].Biological Journal of the Linnean Society,1998,64:449-462.

[26] Lighton J R B,Turner R J.Thermolimit respirometry: an objective assessment of critical thermal maxima in two sympatric desert harvester ants,Pogonomyrmexrugosus andP.californicus[J].Journal of Experimental Biology,2004,207:1903-1913.

[27] Folk D G,Hoekstra L A,Gilchrist G W.Critical thermal maxima in knock down selectedDrosophila:are thermal endpoints correlated?[J].Journal of Experimental Biology,2007,210:2649-2656.

[28] Hoffmann A A.Physiological climatic limits inDrosophila:patterns and implications[J]. Journal of Experimental Biology,2010,213:870-880.

[29] Mitchell K,Hoffmann A A.Thermal ramping rate influences evolutionary potential and species differences for upper thermal limits inDrosophila[J].Functional Ecology,2010,24:694-700.

[30] Overgaard J,HoffmannA A,Kristensen T N.Assessing population and environmental effects on thermal resistance inDrosophilamelanogasterusing ecologically relevant assays[J].Journal of Thermal Biology,2011,36:409-416.

[31] 余 昊.入侵粉虱热激蛋白基因表达与功能[D].北京：中国农业科学院，2009.

(责任编辑： 王 海)

Advances in Evaluation Measures of Thermal Tolerance in Insect

LI Hongbo, HE Yongfu*

(GuizhouInstituteofPlantProtection,Guiyang,Guizhou550006,China)

Insects are ectotherms, and have strong dependence on environmental temperature. Adaptation to temperature stress directly determines population dynamics, life cycles and geographic distribution of insects. To better evaluate thermal tolerance of insect, the authors summarized and evaluated the measures of temperature tolerance.

temperature tolerance; evaluation measures; insect

2015-03-25； 2015-12-28修回

贵州省农业科学院人才引进启动项目“sHsps在粘虫两型中的表达模式研究”(201301)

李鸿波(1985-)，男，副研究员，博士，从事昆虫生理生化与害虫综合治理研究。E-mail:lihongb2007@163.cm

*通讯作者：何永福(1965-)，男，研究员，从事作物病虫草害绿色防控技术应用研究。E-mail:heyongfu08@163.com

1001-3601(2016)01-0022-0080-04

S431

A