甜茶总多酚的纯化及其抗氧化活性

滕昭玉， 崔紫姣 ， 杜 莹， 鲍晨阳 ， 廖莉玲

(贵州师范大学 化学与材料科学学院， 贵州 贵阳 550001)

甜茶总多酚的纯化及其抗氧化活性

滕昭玉， 崔紫姣 ， 杜 莹， 鲍晨阳 ， 廖莉玲*

(贵州师范大学 化学与材料科学学院， 贵州 贵阳 550001)

为提高甜茶的综合利用价值，从提取甜茶甙废液中回收甜茶多酚并采用大孔树脂纯化的方法研究甜茶总多酚的纯化工艺条件；采用紫外分光光度法对甜茶多酚含量及其抗氧化活性进行测定。结果表明:所筛选的HPD826树脂为甜茶总多酚纯化的最佳树脂;当上样液的浓度为3.65 mg/mL、上柱液体积为50 mL、流速为1BV/h时，吸附率为94.25%，用30%的乙醇解吸后其甜茶总多酚的纯度可达56.68%；纯化过的甜茶总多酚对·OH和DPPH·自由基均有较好的清除作用，其IC50值分别为517.9 μg/mL和45.9 μg/mL。

甜茶； 总多酚； 纯化工艺； 大孔吸附树脂； 自由基清除活性

蔷薇科甜茶(RubusSuavissmusS.Lee)又名甜叶悬钩子，生长于贵州、广西等地[1]。甜茶作为民间传统的茶饮料，具有无糖自然甜的作用，经常饮用不仅可以起到滋肝补肾、生津润肺、止咳化痰和利咽的功效，还有提高人体免疫力、防治冠心病以及抗衰老等功效[1]。甜茶作为天然的药食兼用植物，甜茶甙、甜茶多酚、甜茶黄酮是甜茶的主要活性成分，多酚类物质主要包括黄烷醇类(儿茶素类)、花黄素类、花色素类和酚酸类[2]。目前，对甜茶活性成分的提取及其产品的开发主要集中在甜茶甙，而对于含量较多的甜茶多酚和总黄酮的研究相对较少，尤其是提取甜茶甙废液中含有的较多的甜茶多酚未得到有效利用，造成了资源浪费。众多研究表明[2-6]，甜茶的药用价值与其高含量的多酚类物质密切相关，甜茶多酚具有抗炎、抗过敏的能力等，因此对甜茶多酚的深入研究具有重要意义。目前对于甜茶多酚的提取、纯化大多以甜茶叶为原料[7-8]，而从提取甜茶甙的废液中回收甜茶多酚以及纯化前后甜茶多酚的抗氧化活性对比研究却鲜见报道。因此，笔者从现有生产甜茶甙工艺的废液中回收甜茶多酚并利用大孔树脂对其纯化，测定其自由基清除能力，以期为甜茶多酚进一步研究开发以及提高甜茶的综合利用价值提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料与试剂：甜茶叶(购于贵州省健康茶科技有限公司)，二苯基苦味酰基苯肼(DPPH，东京化成株式会社)，其余试剂均为分析纯。大孔吸附树脂SA-2(购于天津欧瑞生物科技有限公司)，吸附树脂HPD600、HPD826、聚酰胺、D-101、AB-8(购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司)。

仪器：FZ102型微型植物粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，SHA-B水浴恒温振荡器(金坛市富华仪器有限公司)，UV2300紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 甜茶总多酚的提取及其含量测定

1.2.1 甜茶总多酚的提取 参照文献[9]报道的方法进行甜茶总多酚的提取和含量测定。

准确称取一定质量的甜茶叶粉末(过40目筛)于圆底烧瓶中，按料液比为1∶10加入水，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过D101大孔树脂，大孔树脂用75%乙醇洗脱用于甜茶甙的提取，过柱液经适当浓缩得到甜茶多酚样液。

1.2.2 多酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸为基准物质，在770 nm波长处测定吸光度，得到没食子酸吸光度与质量浓度之间的回归方程为A=0.125 6 C-0.056 5(R2=0.998 1)。

通过在770 nm处测定供试溶液的吸光度(A)，从标准曲线中算出供试溶液中总多酚的浓度，即可计算供试溶液中总多酚的含量。

1.3 大孔树脂纯化甜茶总多酚的性能

1.3.1 树脂的预处理 称取一定量的大孔树脂，用水冲洗至洗涤水澄清透明、无悬浮杂质，将树脂用无水乙醇浸泡24 h，水洗后分别用4%的酸碱溶液浸泡2 h，水洗至中性，用水浸泡备用。

1.3.2 静态吸附和解吸 准确称取预处理过的树脂2.00 g(记为W)于250 mL的锥形瓶中，加入100 mL液(记为V1)浓度为3.18 mg/mL(记为C0)的甜茶多酚样液，密封后置于恒温振荡器中，24 h后取上清液，测量甜茶多酚浓度(记为C1)。

分离并用水洗涤上述吸附饱和的树脂后置于250 mL的锥形瓶中，加入无水乙醇100 mL(记为V2)，密封后置于振荡器中，24 h后取上清液，测量甜茶多酚浓度(记为C2)。

根据下式计算吸附率(%)、吸附量(mg/g)、解吸率(%)：

吸附率=[(C0-C1)/C0]×100%

吸附量=[(C0-C1)×V1] /W

解吸率={C2V2/[(C0-C1)×V1]}×100%

1.3.3 HPD826树脂的动态吸附和解吸 将预处理过的树脂通过湿法装柱的方式装入1.5 cm×40 cm的层析柱中，树脂体积为30 cm3。

1) 上样液浓度对HPD826树脂吸附的影响。分别取3份质量浓度为2.80 mg/mL、3.65 mg/mL、4.24 mg/mL的甜茶多酚样液150 mL，以1 BV/h流速上柱，每10 mL收集一次流出液，分别测定流出液总多酚含量，以流出液甜茶多酚的质量浓度对流出液管数作图，绘制穿透曲线；合并流出液测定总多酚的含量并计算吸附的甜茶总多酚质量及吸附率。

2) 洗脱剂对HPD826树脂解吸的影响。分别取5份质量浓度分别为3.65 mg/mL的甜茶多酚样液150 mL，以1 BV/h流速上柱，将吸附饱和的树脂用水冲洗至流出液无色，分别用10%、30%、50%、70%和90%乙醇150 mL洗脱，流速为1 BV/h，测定洗脱液中总多酚的含量计算解吸率。

将流出液旋干，准确称取一定质量(W1)的旋干后的固体粉末溶于一定量(V3)的水中，测其浓度(C3)，根据下式计算经树脂纯化后的甜茶总多酚的纯度(%)：

纯度=(C3V3/W1)×100%

1.4 抗氧化活性试验

以维生素C为参照，以甜茶多酚样液浓缩干燥所得样品为甜茶粗多酚(纯度为23.17%)，经大孔树脂纯化后所得样品为甜茶精多酚(纯度为56.68%)，分别测定各样品对·OH和DPPH·自由基的清除能力。以样品浓度为横坐标，以清除率为纵坐标，计算清除率为50%时所对应的样品浓度(IC50)，样品的自由基清除活性以半数清除浓度(IC50)表示。

1.4.1 清除·OH能力 利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm下有最大吸收[10]。

参照文献[11]的方法并略作修改。在10 mL的具塞比色管中依次加入1 mL不同浓度的样品(甜茶粗多酚、甜茶精多酚和维生素C)、7.5 mmol/L硫酸亚铁铵 0.85 mL、7.5 mmol/L水杨酸-乙醇0.85 mL和0.3%的H2O20.85 mL，用蒸馏水定容至10 mL。将比色管置于37℃的恒温水浴中反应30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测量不同浓度样品各反应体系溶液的吸光度(Ai)。未加样品的空白管所测的吸光度为A0。未加0.3%的H2O2溶液的参比管所测的吸光度为Aj，·OH清除率的计算公式为：

·OH清除率=[(A0-Ai+Aj)/ A0]×100%

1.4.2 清除DPPH·自由基能力 参照文献[12]的方法并略作改动。准确移取0.2 mg/mL DPPH·无水乙醇溶液1.6 mL和1 mL不同浓度的样品液(甜茶粗多酚、甜茶精多酚和维生素C)于10 mL具塞比色管中，用无水乙醇定容至10 mL并摇匀，避光放置30 min，用无水乙醇做参比在517 nm处测定吸光度(Ai)。将1.6 mL的0.2 mg/mL DPPH·无水乙醇溶液于10 mL具塞比色管中，并用无水乙醇定容至10 mL，置于暗处30 min，测其在517 nm处的吸光度(A0)。取1 mL不同浓度的样品液，用无水乙醇定容至10 mL，摇匀后暗处静置30 min，以无水乙醇为参比，测其在517 nm处的吸光度为(Aj)。DPPH·清除率的计算公式为：

DPPH·清除率=[(A0-Ai+ Aj)/ A0]×100%

2 结果与分析

2.1 不同大孔树脂的静态吸附和解吸效果

从表1看出，由于树脂的类型不同，树脂对甜茶总多酚的吸附程度亦不同。从吸附率看，聚酰胺最大，但是其解吸较困难，综合考虑吸附率和解吸率等指标，优选HPD826树脂作为甜茶总多酚纯化的树脂，进一步做动态吸附-解吸试验。

表1 6种大孔树脂的静态吸附-解吸效果

Table 1 Static adsorption and desorption ratesof total polyphenols on macroporous resin

编号No．树脂类型 Resin type 吸附量/(mg/g)Adsorptioncapacity吸附率/%Adsorptionrate解吸率/%Desorptionrate1SA⁃218．011．499．62HPD60020．512．999．33HPD82631．519．874．74聚酰胺60．037．629．75D10115．09．499．46AB⁃814．08．899．7

2.2 HPD 826树脂动态吸附和解吸

2.2.1 上样浓度的考察 由图1可知，在一定的流速条件下，用不同浓度的甜茶总多酚过柱，当流出液的体积相同时，上样液的浓度越大，流出液中多酚的浓度增加越明显，即随着样品液浓度的增加，流出液中多酚的含量增加，样品液的利用率降低。流出液中甜茶总多酚的质量浓度达到上样液的10%时，即认为树脂已饱和，发生穿透，当用2.80 mg/mL、3.65 mg/mL和4.24 mg/mL的甜茶总多酚样液过柱时，达到饱和所对应的上柱液体积分别为60 mL、50 mL和40 mL；在此条件下，树脂所吸附的甜茶总多酚的质量分别为159.51 mg、172.01 mg和159.60 mg，所对应的吸附率分别为94.95%、94.25%和94.10%。因此，试验选择上样液浓度为3.65 mg/mL。

图1 不同浓度甜茶总多酚的穿透曲线

2.2.2 洗脱剂浓度的考察 由图2可知，10%的乙醇解吸率最小，当乙醇的体积分数大于30%，解吸率无显著差异，因此选择30%乙醇作为解吸剂。将30%乙醇解吸液浓缩干燥后，测定其纯度约为56.68%，较纯化前的纯度(23.17%)提高33.51%。

图2 不同乙醇体积分数的解吸率

2.3 甜茶多酚的抗氧化活性

2.3.1 对·OH的清除效果 由图3A可见，随着不同样品浓度的增加，其对·OH自由基清除能力均增加，在相同浓度下，甜茶精多酚对·OH自由基的清除能力最强。甜茶粗多酚、甜茶精多酚以及维生素C对·OH自由基的IC50分别为1 234.7 μg/mL、517.9 μg/mL和694.7 μg/mL。表明，甜茶精多酚对·OH自由基具有较强的清除能力。

图3 不同样品对·OH和DPPH·自由基的清除率

Fig.3 ·OH and DPPH· scavenging rate of different samples

2.3.2 对DPPH·的清除效果 由图3B可知，在一定范围内甜茶多酚对DPPH·自由基的清除率随浓度的增加而增加，甜茶粗多酚、甜茶精多酚以及维生素C对DPPH·自由基清除能力的顺序为甜茶精多酚>甜茶粗多酚>维生素C，其IC50值分别为45.9 μg/mL、68.9 μg/mL和89.5 μg/mL，表明纯化后的甜茶精多酚具有较强的清除DPPH·自由基的能力。

3 结论与讨论

1) 在相同条件下以吸附率和解吸率为指标，研究大孔吸附树脂对甜茶总多酚的静态吸附、解吸性能，其中HPD826树脂的吸附率(19.8%)和解吸率(74.7%)较好。因此，选择HPD826作为甜茶总多酚纯化的最佳树脂。

2) 用HPD826树脂对甜茶总多酚样液进行动态吸附、解吸并探究洗脱剂的浓度对解析性能的影响，结果表明，当上样液浓度为3.65 mg/mL、上柱体积为50 mL、流速为1 BV/h时，其吸附率为94.25%；用30%的乙醇洗脱后，其纯度可达56.68%。

3) 利用甜茶粗多酚、甜茶精多酚和维生素C进行体外自由基清除活性的对比，结果表明，甜茶精多酚对·OH和DPPH·自由基具有更好的清除效果，其IC50值分别为517.9 μg/mL和45.9 μg/mL。

通过HPD826大孔树脂可以有效的回收甜茶甙废液中的甜茶多酚，所得到的甜茶多酚具有较好的体外抗氧化作用，对于甜茶多酚的进一步纯化分离以及体内的抗氧化活性有待进一步研究。

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(责任编辑： 孙小岚)

Purification and Antioxidant Activity of Total Polyphenols from Sweet Tea

TENG Zhaoyu， CUI Zijiao， DU Ying， BAO Chenyang， LIAO Liling*

(SchoolofChemistryandMaterialScience，GuizhouNormalUniversity，Guiyang，Guizhou550001，China)

In order to improve the comprehensive utilization of sweet tea, total polyphenol of sweet tea from which rubusoside liquid was extracted and the purification process conditions of total polyphenol from sweet tea were studied by macroporous resins purification method. The concentration of total polyphenol and its antioxidant activity was evaluated by ultraviolet spectrophotometry. The results showed that the resin of HPD826 was optimum for purification of total polyphenols from sweet tea, and when sample concentration was 3.65 mg/mL, volume was 50 mL, sample flow rate was 1BV/h, adsorption rate was up to 94.25%, and the purity of total polyphenols was up to 56.68% by using 30% ethanol as eluent, purified the total polyphenol of sweet tea had better scavenging effect on ·OH and DPPH·, the determined IC50values were 517.9 μg/mL and 45.9 μg/mL respectively.

sweet tea; total polyphenols; purification process; macroporous adsorption resin; radical scavenging activity

2015-07-16； 2015-12-26修回

贵州省科学技术厅中药现代化攻关项目“甜茶多酚、黄酮的提取工艺研究”[黔科合ZY字(2012)3012]；贵阳市科技局现代药业计划项目“甜茶、明日叶多酚、黄酮的提取及应用研究”[筑科合同(2012204)]

滕昭玉(1988-)，男，在读硕士，研究方向：分析化学。E-mail：tengzhaoyu0922@126.com

*通讯作者:廖莉玲(1963-)，女，教授，从事天然产物化学研究。E-mail：lll6383@163.com

1001-3601(2016)01-0011-0036-04

TS201.2

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