黄芪对老年急性髓系白血病患者BCL-2家族凋亡因子的相关影响

余丹 程 辉 易 雪 张 婷

（武汉市第一医院血液内科，湖北武汉430000）

·论 著·

黄芪对老年急性髓系白血病患者BCL-2家族凋亡因子的相关影响

余丹 程 辉 易 雪 张 婷

（武汉市第一医院血液内科，湖北武汉430000）

目的 本研究探讨黄芪（astragalus）对老年急性髓系白血病患者疗效评估，并检测其对患者Bcl-2家族凋亡相关因子的影响，从而探讨黄芪对老年急性髓系白血病患者治疗的作用机制。方法 随机分配42例老年急性髓系白血病患者，分为对照组和治疗组，两组均予以化疗，治疗组在此基础上给予黄芪，统计两组病患治疗后完全缓解率，患者治疗后白血病细胞凋亡情况运用流式细胞仪检验，患者治疗前后Bcl-2，Bax、Bak、BCL-xl的mRNA表达状况运用RT-PCR方法进行检测，统计两组患者治疗后疗效情况。结果 治疗组患者明显优于对照组，治疗组患者完全缓解率高于对照组（P＜0.05）。治疗组患者给予黄芪后，白血病细胞凋亡较对照组明显增高，治疗组治疗后Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak的表达较治疗前差异有统计学意义（P＜0.05），其中Bcl-2、Bcl-xl较治疗前明显下降，Bax、Bak较治疗前明显升高；对照组治疗后Bcl-2、Bax、Bak、BCL-xl表达水平较对治疗前差异无明显统计学意义（P＞0.05）。结论 黄芪能促进白血病细胞的凋亡，提高患者疗效，其机制可能是通过减低Bcl-2、BCL-xl的表达，增加Bax、Bak的表达来完成。

急性髓系白血病；黄芪；Bcl-2；凋亡

急性髓系白血病（AML）是起源于造血干细胞的恶性血液系统疾病，发病率高，诊断时中位年龄为69岁。研究显示老年AML患者疗效差，高龄尤其是70岁以上的患者，总生存率（OS）低和治疗相关病死率高。老年患者脏器功能衰退，常合并心脑血管、内分泌等多系统疾病，大多数老年患者不能耐受化疗，容易耐药复发，治疗效果差。

黄芪的主要成分黄芪多糖具有促进肿瘤细胞凋亡[1-2]的作用。数十年来多项研究表明黄芪对结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤细胞有促进凋亡作用，但也有研究表明，黄芪可促进肿瘤细胞增殖[1-3]。Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak是重要的凋亡相关因子，参与凋亡途径的调控，本次研究拟探讨黄芪对白血病细胞凋亡及凋亡相关因子的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料：初治的年龄＞60岁急性髓系白血病患者42人次，男29人次，女13人次，年龄60～81岁，平均70.5岁，2010年1月至2015年5月在武汉市第一医院血液内科住院患者，以张之南教授的《血液病诊断及疗效标准》为依据，纳入病例，进行病例筛选，并排除急性早幼粒细胞白血病患者，本次临床研究经医院伦理委员会批准，所有患者需签署知情同意书。AML中有7例M1型，12例M2型，10例M4型，9例M5型，2例M6型，并将老年髓系白血病患者随机分为两组，每组各21例，给予CAG、DAG、HAG等预激方案治疗，第一次完全缓解期老年AML患者缓解后的巩固治疗多采用1～2个周期的降低剂量的改良的大剂量阿糖胞苷或重复传统化疗方案（CAG、DAG、HAG等预激方案治疗），治疗组患者每次化疗开始时给予黄芪颗粒30g/d，水冲服至化疗后患者骨髓恢复，并在化疗前及化疗后骨髓恢复后抽取患者骨髓进行分析。

1.2 试验材料与方法：黄芪颗粒，批号1510004W，10g/袋，华润三九医药股份有限公司提供。FACSCalibur流式细胞仪购自碧迪有限公司。PCR：TRIzol购自Invitrogen公司，DMSO购自美国Sigma公司。

流式分选仪检测两组患者白血病细胞凋亡情况。收集患者开始治疗前、后骨髓液。取样品100 μL与单抗20 μL混匀后，室温遮光孵育15 min，加入溶血剂混匀，避光10 min，加入PBS洗涤，离心，弃去上清液，即可上机检测白血病细胞的凋亡率。

两组患者治疗前后Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak等凋亡相关基因mRNA的表达情况通过RT-PCR检测。收集两组AML患者治疗前后骨髓细胞，取肝素（107u/L）抗凝骨髓液4 mL，提取单个核细胞。用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳。PCR引物及参照物引物见表1，提取RNA时使用TRIzol试剂，逆转录合成cDNA作为PCR的反应模板。凋亡相关基因引物如表1，上海英俊生物技术有限公司协助合成引物。取PCR扩增产物5 μL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（含0.5 mg/L的溴化乙锭）（78 v，30 min）后，紫外透射仪观下察结果，以Gene tools软件对电泳条带进行灰度扫描，以各个基因与β-actin电泳带的灰度值的比值（ODR）代表各个基因mRNA的表达水平。以目的基因灰度值与同一样本的β-actin的灰度值的比值作为统计参数。

1.3 统计学处理：采用SPSS 17.0统计学软件进行方差分析和t检验，各基因实验数据以均数±标准差（±s）表示，检验水准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 凋亡相关基因引物序列、退火温度及反应产物长度

2 结果

治疗组患者完全缓解率为57%，对照组为37%，治疗组1名患者因心功能不全未完成化疗，对照组有2名患者分别因为重症肺炎及心功能衰竭未完成化疗。比较两组完全缓解率，显示差异有统计学意义（P＜0.05）。

两组患者治疗前后白血病细胞凋亡情况：通过流式细胞仪检测两组患者治疗前及治疗后第28 d后的骨髓液中白血病细胞，计算其凋亡比例其平均值，治疗组骨髓中白血病细胞受抑率（70.63± 3.17）%为较对照组（52.54±2.98）%明显增高，显示差异有统计学意义（P＜0.05）。

通过RT-PCR方法检测两组患者治疗前后Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak的mRNA的表达，结果显示治疗组20例AML患者有18例表达Bcl-2（阳性率85.71%），对照组20例中17例表达，两组治疗前表达量差异无统计学意义（P＞0.05），治疗组治疗后Bcl-2、Bal-xl mRNA表达量较治疗前明显下降（P＜0.05），治疗组治疗后Bax、Bak mRNA表达量较治疗前明显上升（P＜0.05）。而对照组治疗后Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xl mRNA表达量较治疗前差异无统计学意义（P＞0.05），表达量比较应用t检验，见表2。

3 讨论

急性髓系白血病发病率高，每年发病率为3.6/ 10万，老年患者居多，对化疗耐受差，治疗较为棘手。黄芪中的主要成分黄芪多糖具有治疗实体肿瘤的作用，但未见其对老年急性髓系白血病疗效的报道。本文将黄芪联合化疗治疗老年AML，加用黄芪组患者完全缓解率及白血病细胞凋亡率较对照组明显增高，且差异具有统计学。黄芪有助于提老年急性髓系白血病的疗效，而其作用机制尚待研究[4-5]。

表2 Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xl在治疗组和对照组治疗前后mRNA表达情况

Bcl-2基因是最早发现的抑制细胞凋亡的基因[6]。染色体异位t（14，18）（q31，q21）断裂点处发现的B cell lyphoma/leukemia 2，即Bcl-2基因在14号染色体上受IgH启动子、增强子控制，导致过度表达。在某些肿瘤组织中高表达Bcl-2基因，可促进细胞抵抗外界环境刺激和压力，阻止程序化死亡[7]。在初诊的AML中，Bcl-2基因阳性率各家报道不一，78.6%～100%[8-10]。本研究发现与文献相似，AML病人的细胞中有Bcl-2基因的高表达达85.71%，进一步证实了Bcl-2基因的紊乱在AML的发病中起重要作用。Bcl-2家族成员众多，根据功能不同分为抑制凋亡基因和促进凋亡的基因。Bcl-xl是Bcl-x基因通过mRNA剪切形成的蛋白具有抑制细胞凋亡的作用。Bcl-xl、Bax、Bcl-2三者形成一个凋亡调控体系。Bax可与Bcl-2形成异源二聚体，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，从而促进细胞凋亡；Bcl-2中的BH1或BH2区域特定氨基酸置换后，能形成同源二聚体后，Bax不能与Bcl-2形成二聚体，丧失促进凋亡的功能。Bax基因失活导致肿瘤迅速生长，表明Bax基因也许是一个肿瘤抑制基因。Bax较易于Bcl-2结合，形成异源二聚体，比Bax/Bax同源二聚体稳定性好，而当细胞Bcl2降低时，Bcl-2/Bax二聚体下降，Bax/Bax就较易形成，促进Bax的凋亡作用。假如有Bcl-xs存在时，优先与Bcl-2结合，使得Bax/Bax同源二聚体比例增加，促进细胞凋亡。Bak结构与Bcl-2相似，能与Bcl-xl形成异源二聚体，其BH3结构域通过抑制Bcl-2和Bcl-xl，促进细胞凋亡。

本实验研究发现黄芪多糖治疗老年急性髓系白血病后患者体内Bcl-2、Bcl-XL较治疗前明显下降Bax、Bak较治疗前明显上升。而对照组中虽有所改变，但无明显统计学差异，综合本研究黄芪可能是通过对Bcl-2家族的作用通路促进白血病细胞凋亡。黄芪促进白血病细胞凋亡，改善老年AML患者疗效，为攻克老年AML提供新的思路，而其可能是通过Bcl-2家族凋亡因子而发挥作用，而其是否存在其他作用途径有待进一步研究。

［1］ 许杜娟，陈敏珠.黄芪总提物抗肿瘤作用及其机制研究［J］.中华中医药杂志，2006，21（12）：771-772.

［2］ 陈光，臧文臣，刘显清，等.黄芪多糖对动物肿瘤细胞凋亡影响的研究［J］.中医药学报，2002，30（4）：55.

［3］ Tin MM，Cho CH，Chan K，et al.Astragalus saponins induce growBth inhibition and appotosis in human colon cancer cells and tumorxenograft［J］.Carcinogenesis，2007，28（6）：1347-1355.

［4］ 崔澂，吕克蔺，刘秀萍，等．黄芪注射液体外促进宫颈癌细胞增殖及其调控分子表达分析［J］．中药药理与临床，2014，30（6）：105-108．

［5］ 谷俊朝，余微波，王宇，等.黄芪多糖对TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生长及HSP70表达的影响［J］.中华肿瘤防治杂志，2006，13（20）：1534-1537.

［6］ Osorio LM，Jondal M.Aguiiar-Santelises M.Regulation of B -CLL apoptosis through membra ne receptors and Bcl-2 familyproteins［J］.LeukemiaandLymphoma，1998，30：247-256.

［7］ Kwan Chang Kim MD，Jae Chul Lee PhD，Hyeryon Lee MS，et al.Changes in Caspase-3，B Cell Leukemia/Lymphoma-2，Interleukin-6，Tumor Necrosis Factor-α and Vascular Endothelial Growth Factor Gene Expression after Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cells Transfusion in Pulmonary Hypertension Rat Models［J］.Korean Circ J，2016，46（1）：79-92.

［8］ Nguyen JC，Kubik MJ，Broome HE，et al.Successful treatment of both double minute of C-MYC and BCL-2 rearrangement containing large B-cell lymphoma with subsequent unfortunate development of therapy-related acute myeloid leukemia with t（3;3）（q26.2;q21）［J］.Pathol Res Pract，2015，211（11）：883-891.

［9］ Sahu G1，Jena RK.Clinical significance of P53 and Bcl-2 in acute myeloid leukemia patients of Eastern India［J］.Hematol Rep，2011，19;3（3）：91-94.

［10］Wang M1，Wang LR，Cui JY，et al.Expression and clinical significance of B-cell lymphoma 2（BCL-2）in hyperleukocytic acute myeloid leukemia［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2013，21（4）：851-856.

The Influence of Astragalus on Apoptosis Related Factors Bcl-2’s Famlily in Eld Patients with Acute Myeloid Leukemia

Yu Dan Cheng HuiYi Xue Zhang Ting
（Wuhan First Hospital Blood Internal Medicine，Wuhan 430000，China）

ObjectiveIn order to disscuss the underlying treatment mechanism of astragalus on eld patients with acute myeloid leukemia，this study was purposed to investigate the efficacy of astragalus in the treatment of eldly patients with acute myeloid leukemia and the influence of astragalus on atopsoptosis（apoptosis related factors）Bcl-2’s famlily in the patients.Method There were 42 eld patients with AML divided into the treatment and the control groups randomly.Both of the groups were treated with chemotherapy and the treatment group received astragalus more.The rates of complete remission were analysed，the apoptosis of leukemia cells was quantitatively examined by FCM，the expressions of Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak mRNA were detected by Realtime-PCR before and after therapy，The effectiveness of the two groups would be observed after treatment.ResultThe complete remission rate of the treatment group was statistically higher than the control one（P＜0.05）.The apoptosis rates of leukemia cells in the treatment group after the therapy were significantly higher than the control group.The mRNA expressions of Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak were especially different from the expressions before therapy in the treatment group（P＜0.05）.The expressions of Bcl-2 and Bcl-xl were notably lower than before therapy in the treatment group（P＜0.05）.The Bax and the Bak mRNA expressions were especially higher than before therapy in the treatment group（P＜0.05）.The mRNA expressions of Bcl-2、BCL-xl、Bax、Bak had no significant difference from the expressions before therapy in the control group（P＜0.05）.ConclusionAstragalus could promote the process of apoptosis for the leukemia cell and improve the patient’s treatment effect.The mechanism of these may be related to the increases of the apotosis for leukemia cells by reducing the expressions of Bcl-2 and Bcl-xl and promoting the expressions of Bax、Bak.

Acute myeloid leukemia；Astragalus；Bcl-2；Atopsoptosis

R73-34

A 学科分类代码： 32024

1001-8131（2016）05-0501-03

2016－06－30

武汉市科技局课题＜AML白血病干细胞表观遗传学改变的研究初探＞（201161038341-02）