产黏液分枝杆菌的生物学特征及快速药敏试验分析

刘美清，兰　英，蔡　曼，袁　慧，范雪松，刘玉磊，王爱萍

(1.首都医科大学附属北京安贞医院检验科, 北京　100029；

2.中国科学院微生物研究所，北京　100101)



产黏液分枝杆菌的生物学特征及快速药敏试验分析

刘美清1，兰英2，蔡曼1，袁慧1，范雪松1，刘玉磊1，王爱萍1

(1.首都医科大学附属北京安贞医院检验科, 北京100029；

2.中国科学院微生物研究所，北京100101)

摘要：目的了解产黏液分枝杆菌的生物学特征，并进行菌种鉴定和药敏分析，为临床准确诊断和治疗提供科学依据。方法从患者血需养培养瓶中分离出的可疑菌株，经生长时间、快速革兰染色及萋-尼氏法抗酸染色初筛后，基于16S rRNA基因及rpoB基因序列分析检测菌株种类，并进行相应的快速药物敏感性检测。结果最终鉴定为非结核分枝杆菌中的产黏液分枝杆菌，属于快速生长分枝杆菌类；K-B法体外药敏试验显示，抑菌环直径30 mm以上从大到小依次为：克拉霉素、阿米卡星、头孢克罗、头孢噻肟、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林﹣克拉维酸、亚胺培南、奈替米星、阿奇霉素。结论产黏液分枝杆菌有致病性，可引起菌血症，临床应根据患者自身情况，尽早拔除导管，需进行抗感染治疗时依据药敏结果合理用药，防止院内感染的发生。

关键词:非结核分枝杆菌； 产黏液分枝杆菌； 16S rRNA；菌种鉴定；聚合酶β亚单位

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)可通过呼吸道、胃肠道、皮肤黏膜等途径侵入人体，可引起无症状的感染，多在机体抵抗力低下时发病，可导致淋巴结炎、慢性肺部疾病、皮肤和软组织感染以及全身播散型NTM病等。因此，NTM快速准确的菌种鉴定对疾病的诊断和治疗有着极其重要的意义。本实验从患者血需养培养瓶中分离出NTM菌株并进行了分子生物学快速鉴定和药敏试验分析，鉴定结果为产黏液分枝杆菌(Mycobacterium mucogenicum)，属于快速生长分枝杆菌类，现报道如下。

1材料和方法

1.1标本来源患者男，22岁，身高170 cm，体质量87 kg。体检发现降主动脉假性动脉瘤。患者有胸闷、左侧胸痛、心慌、气短，既往无高血压、冠心病、糖尿病、肝炎、结核及其他传染病史，2014年8月5日入住心外科病房，8月25日在全麻体外循环下行降主动脉替换术。次日转出ICU回普通病房，患者体温持续升高，次日和第3日体温最高达39.8℃，WBC 23.77 G·L-1,NE88.3%；第3天抽取1套血培养，结果为需养瓶培养阳性，厌氧瓶培养5 d阴性；第4天恢复正常或稍高；第6天WBC 14.67 G·L-1，NE73.7%，体温又升高至38.6℃；第7天拔除引流管体温下降至37.5℃；第8天拔除中心静脉管后并复查血培养结果阴性。患者先后应用头孢孟多酯钠、美罗培南、头孢噻利、特治星，术后恢复良好，于9月2日出院。

1.2仪器与试剂血培养瓶、哥伦比亚血琼脂和麦康凯平板由Oxoid公司提供。GBB16型CO2培养箱；快速革兰染液、萋-尼氏抗酸染液由珠海贝索生物技术有限公司提供；2× Taq PCR MasterMix(包括了TaqDNA聚合酶、dNTP和优化的反应缓冲液)和基因组DNA小量提取试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司提供；16 s rRNA及rpoB基因引物由上海生工生物技术有限公司合成。结核分枝杆菌H37RV敏感株(ATCC 27294)来自北京结核病胸部肿瘤研究所参比室。

1.3方法

1.3.1菌株的分离培养血需养培养瓶阳性报警后，分别转种于血琼脂平板和麦康凯平板，置5%～10%CO2培养箱中培养24～72 h，麦康凯平板不生长，在血琼脂平板上可见灰白色、蜡样菌落生长，标本号命名为10624，并进行后续实验。

1.3.2涂片染色挑取单个菌落涂片后，分别进行快速革兰染色和萋-尼氏法抗酸染色。

1.3.3分子生物学快速鉴定 (1)基因组DNA快速提取：用无菌接种环挑取1～3个菌落，加入25 μL 0.5% Chelex溶液，充分振荡混匀，沸水浴10～15 min。12 000 rpm离心1min。上清液即为所提取的基因组DNA溶液，-20℃下保存备用。(2)16S rRNA基因克隆：正向引物27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492r: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系(100 μL)：2xEasyTaq PCR SuperMix：50 μL；正向引物：2.0 μL；反向引物：2.0 μL；DNA模板：6.0 μL[1]；无菌纯水：40.0 μL；PCR扩增反应程序：94℃预变性4 min。94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1 min为一个循环，扩增35个循环后，72℃延伸10 min。PCR扩增完成后，产物在-20℃下保存。(3)rpoB(聚合酶β亚单位)基因克隆：引物设计根据标准菌株H37Rv(GenBank accession number L27989)的rpoB基因保守区设计。正向引物MycoF:5′-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3′；反向引物MycoR: 5′-AGCGGCTGCTGGGTGATCATC -3′。具体操作步骤同上。(4) 抗菌药物敏感试验：采用K-B法检测，将菌液调至0.5麦氏单位，具体操作严格按照《全国临床检验操作规程》，在血琼脂平板上进行待检菌株对各种抗菌药物的敏感性检测，48 h后量取抑菌环直径。(5)生理生化实验：使用梅里埃(BIOMERIEUX，法国)公司细菌鉴定试剂盒API ZYM和API 20E检测菌株的生理活性，操作步骤按说明书完成。

1.4抗煮沸试验非致病株煮沸1 min即失去抗酸性，而致病株能耐10 min，甚至高压灭菌也不失去抗酸性。用于区分产黏液分枝杆菌是否具有致病性。

2结果

NTM生物学特征包括生长速度、色素、菌落形态和生化特征等，此类细菌在形态、染色等方面具有与结核杆菌相似的性状,但又不完全相同。本实验血需养培养瓶报警时间116.73 h。

2.1血培养液直接涂片快速革兰染色红色背景下菌体呈蓝色，内含有链状排列的异染颗粒；有的只见链状排列的异染颗粒，菌体淡粉色。

2.2菌落形态将血标本转种培养24h后血平板上，可见灰色、针尖样细小菌落。48 h后可见干燥、灰白色、小菌落。72 h后菌落逐渐呈蜡样外观、灰白色、圆形、突起、边缘不整齐、粗糙型菌落，直径0.5～2 mm。用接种环涂片时，菌落易碎，在玻片上能完全乳化于蒸馏水内。

2.3菌落快速革兰染色菌体为革兰阳性半透明，大小略长于结核分枝杆菌，细长直或微弯曲，有的呈梭形，粗细不一，有时有分支。菌体内含有1个至多个异染颗粒，1个颗粒多在菌体一端或中部，培养一周后再染色，可见位于顶端的颗粒膨大至菌体两倍，似火柴头样；多个异染颗粒可按串珠样排列至整个菌体。

2.4抗酸染色显微镜检查发现菌体形态异常的分枝杆菌后进行萋-尼氏抗酸染色，大部分阴性(菌体呈蓝色)和少量阳性(菌体呈淡粉色和红色)。

2.5基因快速鉴定待检菌株的16S rRNA基因的测序结果经GenBank数据库比对，结果与Mycobacterium phocaicum(富西亚分枝杆菌)，菌株编号CIP108542(T)，序列登陆号AY859682的相似性为100.00%；与Mycobacterium mucogenicum(产黏液分枝杆菌)，菌株编号ATCC 49650(T)，序列登陆号AY457074的相似性也为100.00%；因此，利用16s rRNA基因不能将本次临床上分离到的菌株鉴定到种水平。

进一步实验将待检菌株加测rpoB基因。菌株10624的rpoB基因的测序结果经GenBank数据库比对，结果与Mycobacterium mucogenicum，菌株编号NTM-0046，序列登陆号KM234050的相似性为100.00%。与Mycobacterium phocaicum CIP 108542相似性96%，序列登录号AY859692。通过构建rpoB gene系统进化树，说明菌株10624与M. mucogenicum菌株聚在了一枝，与Mycobacterium phocaicum菌株聚在了另一枝，进化关系较远，再结合生理生化特征进行比较，由此可以确定菌株10624为产黏液分枝杆菌。见表1，图1。

2.6产黏液分枝杆菌K-B法体外药敏试验试验显示，敏感性抗菌药物的抑菌环直径30 mm以上从大到小依次为：克拉霉素、阿米卡星、头孢克罗、头孢噻肟、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林﹣克拉维酸、亚胺培南、奈替米星、阿奇霉素。对各种抗菌药物的检测结果见表2。

表1　菌株10624与M.mucogenicum、M.phocaicum

注：*数据来自于参考文献(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2006), 56, 133-143)

图1　基于rpoB基因序列构建的分枝杆菌属

抗菌药物纸片浓度(μg/片)直径/mm抗菌药物纸片浓度(μg/片)直径/mm氟罗沙星(FLE)50头孢唑啉(CZ)3021罗美沙星(LMF)100头孢噻肟(CTX)3040环丙沙星(CIP)510氨苄西林(AM)1040青霉素(G.P)10IU/片28头胞呋新(CXM)3030红霉素(E)1523利福平(RA)50氯霉素(C)3020四环素(TE)3013阿奇霉素(AZI)1530复方新诺明(SXT)1.2520克林霉素(CM)20阿米卡星(AN)3045强力霉素(DO)300头孢他啶(CAZ)3015克拉霉素(CLA)1545头孢噻吩(CF)3025妥布霉素(TM)1025头孢哌酮(CFP)7520万古霉素(VA)3020哌拉西林(PIP)10038奈替米星(NET)3034苯唑西林(OX)10头孢曲松(CRO)3020呋喃妥因(FT)3000头孢克罗(CEC)3040头孢西丁(FOX)3028亚胺培南(IPM)1036阿莫西林﹣克拉维酸(AMC)3038

3讨论

近年来，NTM患病率和分离率不断提高，目前已知可使人致病的NTM约有30余种[2]，其中大多数NTM是条件致病菌，少数为致病菌，分为缓慢生长分枝杆菌和快速生长分枝杆菌两大类，均与医院感染密切相关，最常见的是快速生长分枝杆菌，其中包括产黏液分枝杆菌。产黏液分枝杆菌于1995年Springer首先报道，属偶然分枝杆菌群的成员，在固体培养基上能高产黏液样物质，它可引起创伤后皮肤感染和败血症，还可引起骨关节感染、医院感染等。

NTM种类繁多，引起人类感染的因素也不同。一方面，人可从环境中感染患病，水是重要的传播途径。因为医院供水系统使用的镀锌管道可使NTM长期生存，可能为导致医院内感染的主要因素。不同地区分枝杆菌检出率各有不同，NTM检出率最高可达89.3%[3]。另一方面，接触污染的医疗用品和器械而引起感染，多为手术、注射及各种侵入性检查治疗中消毒隔离操作不规范等[4]引起。因此，预防和控制NTM引发的院内感染关键是需要抓好医院用水以及医疗器械的消毒灭菌工作。

有研究显示，从无菌部位如血、骨髓、脑脊液、滑囊液、肺活检标本等检测出NTM,肯定是致病菌，但其致病性相对于结核分枝杆菌要低一些[5]，而且NTM的不同菌种对人的致病力也不相同。本实验中产黏液分枝杆菌经过抗煮沸试验后，抗酸染色仍为阳性，说明产黏液分枝杆菌确实具有一定的致病性，可引起菌血症的发生，所致菌血症则大多与长时间留置静脉导管污染有关[6]。由于中心静脉导管具有操作简便易行、穿刺次数少、可以长期留置等诸多方面优势[7]，而导致临床广泛应用。本研究患者由于病情严重，实施大血管手术后，需要中心静脉置管进行输液等治疗，所以置管时间长，易导致感染的发生。因此，最好的治疗方法是尽早拔除导管，根据患者情况再决定是否需要抗感染治疗，减少或避免院内感染发生。

NTM的鉴定试验主要包括细菌学鉴定和分子生物学鉴定两大类。目前，临床上常采用的抗酸杆菌涂片检查，仅有25%～35%的阳性率[8]，检出率较低。传统的菌种鉴定采用对硝基苯甲酸(PNB)培养基和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基进行分枝杆菌初步鉴定，但其不能进行NTM种的鉴定[9]。随着分子生物学技术的发展，人们研究建立了多种分子检测技术，使NTM菌种快速鉴定得以实现，如PCR-直接测序、PCR-RFLP、PCR-探针杂交和基因芯片等技术。

新的研究认为NTM细胞表面的疏水性及细胞壁通透屏障是其广谱耐药性生理基础，是有效化疗的障碍。导致大多数NTM对一线的抗结核药物天然耐药，有的耐药率为100%[10]，甚至有的患者在抗结核治疗的期间，可能由于患者自身的免疫能力下降或受外部环境刺激而诱发合并感染。因此，临床多采用联合用药的原则，大环内酯类的克拉霉素、阿奇霉素和氨基糖苷类的阿米卡星，以及利福霉素类衍生物的利福布丁，外加一线抗结核药物的乙胺丁醇，对NTM均具有良好的抗菌活性，是首选的药物治疗方案[11-12]。目前传统的检测快速生长分枝杆菌的药物敏感性的方法多采用绝对浓度法、比例法、微量稀释MIC法,均需较长的时间。本实验室由于条件有限，只能采用纸片K-B法进行体外药敏试验检测，抑菌环直径30 mm以上从大到小依次为：克拉霉素、阿米卡星、头孢克罗、头孢噻肟、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林﹣克拉维酸、亚胺培南、奈替米星、阿奇霉素。临床可参考具体药敏结果选择使用，以便制定合理化的治疗方案，提高抗菌药物使用的合理性，有利于降低不良反应的发生率。

本研究表明，单纯应用16 s RNA基因测序同样不能将NTM鉴定到种，而将16 s RNA基因和rpoB基因联合应用，能够在2～4 d内将NTM菌株鉴定到种，再结合抗菌药物敏感试验，能够为临床医生提供有效的诊断依据。因此快速的菌种鉴定和药敏试验结果对感染NTM患者的准确诊断、制定有效治疗方案、控制院内感染等均具有非常重要的意义。

参考文献：

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◇药物与临床◇

Biological characteristics of mucus producing mycobacterium and

fast susceptibility testing

LIU Mei-qing1,LAN Ying2, CAI Man2, et al

(1.BeijingAnzhenHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100029，China;

2.InstituteofMicrobiologyChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China)

Abstract:Objective To explore the biological characteristics of mucus producing mycobacterium and carry out strain identification as well as susceptibility analysis to provide a scientific basis for accurate clinical diagnosis and treatment. Methods Suspected strains, isolated from the blood aerobic culture flasks of patients, were screened by the growth time, rapid Gram stain and Ziehl - Nigeria 's acid-fast staining. The strains were detected on 16S rRNA gene and rpoB gene sequence analysis and the corresponding rapid drug susceptibility testing.ResultsSuspected strains were identified as mucus producing mycobacterium of non-tuberculous mycobacteria, a rapidly growing mycobacteria class. KB vitro susceptibility testing showed that drugs with zone diameters above 30mm in descending order were clarithromycin, amikacin, cefaclor, cefotaxime, ampicillin, piperacillin, amoxicillin/clavulanic acid, imipenem, netilmicin, and azithromycin. ConclusionsMucus producing mycobacterium is pathogenic and can cause bacteremia. To prevent nosocomial infection, we should remove urethral catheter as early as possible according to the patient's own condition and use rational drug based on susceptibility results.

Key words:non-tuberculous mycobacteria；mucus producing mycobacterium；16S rRNA； strain identification；rpoB

收稿日期：(2015-07-06，修回日期：2015-11-06)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.053