白藜芦醇对胆道梗阻再通大鼠肝功能的保护作用

许朝龙，邬善敏，苗志钊，赵凯亮，陈　飞，范迪欢

(武汉大学人民医院肝胆腔镜外科，湖北 武汉　430060)



白藜芦醇对胆道梗阻再通大鼠肝功能的保护作用

许朝龙，邬善敏，苗志钊，赵凯亮，陈飞，范迪欢

(武汉大学人民医院肝胆腔镜外科，湖北 武汉430060)

摘要：目的研究白藜芦醇(Res)对胆道梗阻再通大鼠肝损害的保护作用及机制。方法雄性Wistar大鼠60只，随机分为4组，即A组:假手术组，B组：梗阻性黄疸模型组，C组：梗阻性黄疸模型+胆道再通组，D组:梗阻性黄疸+胆道再通 +Res干预组。连续给药7 d,实验结束后检测各组大鼠血清中总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)水平；RT-PCR检测肝组织沉默信息调控因子1(SIRT1)mRNA的表达，Western blot检测肝组织SIRT1蛋白和核因子-κB(NF-κB)蛋白表达，免疫组化检测过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)蛋白在肝脏中的表达，原位末端标记(TUNEL)法检测肝细胞凋亡。结果与假手术组比较，模型组血清ALT水平升高，SIRT1 mRNA及蛋白、PPARα蛋白表达降低，NF-κB蛋白表达升高，细胞凋亡率升高(P<0.05)；而造模后胆道再通组与模型组比较，血清ALT水平降低，SIRT1 mRNA及蛋白、PPARα蛋白表达增加，NF-κBp蛋白表达降低，细胞凋亡率降低(P<0.05)；白藜芦醇组与C组比较：血清ALT水平降低，SIRT1 mRNA及蛋白、PPARα蛋白表达增加，NF-κBp蛋白表达降低，细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论Res可能通过激活SIRT1抑制NF-κB，发挥抗炎、抗凋亡作用，通过促进PPARα的表达发挥抗氧化作用，从而减轻胆道梗阻再通大鼠的肝损害，促进肝功能恢复。

关键词：白藜芦醇；梗阻性黄疸；再通；沉默信息调控因子；过氧化物酶体增殖物剂激活受体α；核因子-κB

白藜芦醇是广泛存在于多种植物中的一种多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗糖尿病等多种生物活性[1-2]。近年来研究发现，白藜芦醇对化学性肝损伤、酒精性肝损伤具有保护作用[3-4]，但其对胆道梗阻再通大鼠肝损伤的保护作用报道尚少。本研究旨在通过白藜芦醇干预胆道梗阻再通大鼠，通过检测SIRT1、PPARα、NF-κB等蛋白的表达，探究白藜芦醇对胆道梗阻再通大鼠肝损害的保护作用及机制。

1材料与方法

1.1材料Res购自阿拉丁公司，纯度≥99%；兔抗大鼠SIRT1抗体购于santa cruz公司，兔抗大鼠NF-κB抗体、免疫组织化学染色用PPARα抗体购于abcam公司，DAB显色试剂盒(黄)及二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于Roche Applied Science；总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒购自Fermentas公司，引物由金斯瑞科技有限公司合成，实时荧光定量PCR仪ABI 7900。

1.2动物分组及模型建立、标本取材健康雄性Wistar大鼠60只，体质量220～250 g，由湖北省疾控中心提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2003-0005，随机分为4组，每组15只：A组(假手术组)、B组(梗阻性黄疸组1周组)、C组(梗阻性黄疸1周，胆道再通1周+生理盐水组)、D组(梗阻性黄疸1周，胆道再通1周+Res组)；模型建立：大鼠麻醉后，取上腹部正中纵行切口，A组：暴露胆总管但不结扎不横断，关腹，B、C、D组分别暴露胆总管，以4到0号丝线双重结扎，于两结扎丝线间离断，确定无胆瘘后关腹，C、D组分别于胆总管结扎1周后取原切口入腹，显露胆总管，穿刺抽吸出胆汁，取长约1 cm细硅胶管于胆总管和距离幽门2 cm处的十二指肠处分别做荷包缝合、固定，确定无胆瘘后关腹，制成梗阻性黄疸胆道再通模型，D组于再通术后12 h开始每天10 mg·kg-1·d-1Res腹腔注射，C组予以等量生理盐水腹腔注射；建模后第7天取血后处死，取部分肝组织经4%多聚甲醛固定，其余肝组织冻存，进行后续检测。

1.3肝功能检测及病理学观察各组小鼠血液标本静置、离心后收集血清，采用全自动生化分析仪检测ALT、TBIL、DBIL,肝组织石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肝脏形态学变化。

1.4 RT-PCR检测肝组织SIRT1 mRNA表达取肝组织100 mg，用Trizol试剂提取mRNA，按照cDNA合成试剂盒说明，以所提取的mRNA为模板合成cDNA，进行PCR循环。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照，上游引物：5‘-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，下游引物：5‘-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’，大小为252 bp；SIRT1上游引物：5‘-GGCCTCAAAGTACCTGGGAT-3’，下游引物：5‘-AGTCACTAGAGCTTGCGTGT-3’，大小约180 bp。反应条件：第一个循环50°C 2 min，95°C 10 min，然后40个循环95°C 30 s，60°C 30 s，作扩增曲线观察各样本扩增效率是否一致，于扩增后作熔解曲线以检测产物的均一性；mRNA含量用相对值法即2-△△Ct进行统计学分析。

1.5Western blot检测肝组织SIRT1蛋白、NF-κB蛋白的表达取各组肝组织，加入预冷的组织裂解液(RIPA)匀浆组织，置冰上裂解20 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液测蛋白浓度后，各样品取50 μg总蛋白上样电泳，根据蛋白分子量配制10%的PAGE胶电泳，根据预染Marker显示，判断目的蛋白得到充分分离后，停止电泳。取出凝胶根据Marker切下目的条带，转至经甲醇处理的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，转膜条件为：SIRT1先200 mA 120 min，后300 mA 50 min；NF-κB 200 mA 120 min。用含5%脱脂奶粉的封闭液(TBST)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。用封闭液稀释相应的一抗(SIRTl 1∶300稀释，NF-κB 1∶400稀释)，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，每次5 min。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗1∶50 000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h。用TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，每次5 min。每张膜滴加适量增强型化学发光试剂(ECL)底物液，孵育数分钟，行显影、定影处理，图像分析蛋白条带。

1.6免疫组化检测肝组织PPARα蛋白表达肝组织石蜡切片脱蜡、抗原修复，加一抗4℃湿盒中孵育过夜，滴加聚合物辅助剂，37℃孵育20 min，滴加辣根过氧化物酶标记二抗IgG多聚体，37℃孵育30 min，滴加DAB液显色，依次进行复染、脱水、封片，每张切片随机选取5个视野，在显微成像系统400倍下摄片，所有照片均用Image Pro Plus图像处理软件分析测定累积光密度及面积，计算阳性表达的平均光密度。

1.7TUNEL法检测细胞凋亡肝组织石蜡切片脱蜡，滴加蛋白酶K工作液常温反应20 min,PBS洗涤后加50 μL TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 μL荧光素标记溶液)，37℃避光孵育60 min,PBS洗涤3次，每次5 min，加50 μL converter-POD于标本上，37℃避光孵育30 min。PBS洗涤,4次,每次5 min，滴加DAB液显色5～10 min,用自来水冲洗后，苏木素复染，脱水透明，封片。以细胞呈棕褐色为阳性判定标准。每张切片随机选取5个视野计数，计算凋亡指数(凋亡指数=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%)。

2结果

2.1各组大鼠血清TBIL、DBIL、ALT检测结果B组的TBIL、DBIL、ALT水平明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05),C、D组的TBIL、DBIL、ALT水平低于B组(P<0.05)，D组的ALT水平低于C组(P<0.05),C、D组的TBIL、DBIL水平差异无明显统计学意义(P>0.05),见表1。

组别TBIL/μmol·L-1DBIL/μmol·L-1ALT/U·L-1A5.07±0.812.86±0.4639.47±5.23B166.32±10.41a113.27±9.85a209.53±12.14aC6.11±1.48b3.36±0.72b76.42±9.05bD5.81±1.03bd3.04±0.57bd53.75±8.26bc

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05、dP>0.05。

2.2各组大鼠肝脏SIRT1 mRNA表达水平B组SIRT1 mRNA水平低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，C组SIRT1 mRNA水平高于B组(P<0.05)，D组SIRT1 mRNA水平高于C组(P<0.05)，见图1、2。

图1　各组大鼠肝脏SIRT1 mRNA的RT-PCR扩增

图2　各组肝脏SIRT1 mRNA RT-PCR半定量

注：与A组比较，*P<0.05，与B组比较，#P<0.05,与C组比较，△P<0.05。

2.3各组大鼠肝脏SIRT1蛋白、NF-κB蛋白表达水平B组与A组比较，SIRT1蛋白水平降低，NF-κB蛋白水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；C组与B组比较，SIRT1蛋白水平升高，NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)；D组与C组比较，SIRT1蛋白水平升高，NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)，见图3。

注：与A组比较，*P<0.05，与B组比较，#P<0.05,与C组比较，△P<0.05。

2.4各组大鼠肝脏PPARα蛋白表达A组细胞核染色呈明显棕黄色，PPARα蛋白表达呈阳性，B组细胞核染色较A组明显减弱，C组细胞核染色较B组增强，D组细胞核染色较C组增强(如图4)。A、B、C、D组PPARα蛋白表达半定量结果如图5。

图4　各组大鼠肝脏PPARα蛋白表达的

图5　各组大鼠肝脏PPARα蛋白表达半定量结果　　图6 各组大鼠肝细胞凋亡率

注：与A组比较，*P<0.05，与B组比较，#P<0.05,与C组比较，△P<0.05。

图7　各组大鼠肝组织TUNEL染色结果(×400)

2.5各组肝细胞凋亡率B组肝细胞凋亡率较A组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，C组肝细胞凋亡率较B组降低(P<0.05)，D组肝细胞凋亡率较C组降低(P<0.05)，如图6、7。

2.6SIRT1蛋白与NF-κB蛋白表达水平的相关性分析SIRT1蛋白表达水平与NF-κB蛋白表达水平呈负相关(r=-0.86、P<0.01)。

3讨论

梗阻性黄疸(obstructive jaundice)是临床常见疾病，可导致机体各器官系统损害及相应的病理生理改变，其中最主要为肝脏损伤。梗阻性黄疸肝脏损伤的机制主要为脂质过氧化损伤、肠源性内毒性血症、肝脏血流动力学紊乱和各种炎症因子介导的损伤[5-6]。

SIRT1是一种依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶，参与机体许多生理功能的调节，具有促进线粒体能量代谢、维持糖脂代谢平衡、改善心血管功能、抗肿瘤、抗衰老等作用[7]。而白藜芦醇是最广泛使用的SIRT1激活剂[8]。NF-κB是一类具有转录调节功能的核蛋白因子，能调节多种靶基因的表达，与炎症反应、免疫应答、细胞凋亡等病理生理过程密切相关[9]。抑制NF-κB的表达可降低炎性因子IL-1、TNF-α的水平[10]。研究表明[11]，SIRT1可使NF-κB去乙酰化，进而抑制NF-κB活性，发挥抗炎作用。本研究发现，胆道梗阻后(B组)SIRT1 mRNA及蛋白表达下降、NF-κB表达增加、肝细胞凋亡增加，胆道再通后(C组)SIRT1 mRNA及蛋白表达升高、NF-κB表达降低、肝细胞凋亡降低，胆道再通同时予以白藜芦醇干预后(D组)SIRT1 mRNA及蛋白表达进一步升高、NF-κB表达进一步降低、肝细胞凋亡进一步降低。对SIRT1蛋白与NF-κB蛋白的相对表达量进行分析发现，两者之间存在明显的负相关。说明白藜芦醇能通过激活SIRT1表达，抑制NF-κB表达，减轻胆道梗阻再通大鼠的肝细胞损害，减少细胞凋亡。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是配体激活的的转录因子核受体超家族成员之一，有多种生物学作用，如参与糖类和脂质的代谢，提高胰岛素的敏感性，抑制炎症反应，调节细胞生长和分化等[12]。它存在3种亚型：PPARα、PPARβ/δ、PPARγ，其中PPARα主要分布于脂肪酸氧化活跃的组织，如肝、肾和心肌等。实验发现，白藜芦醇能增强PPARα表达[13]，PPARα被激活后，与过氧化物酶体增殖物反应元件(PPREs)结合，能增强多个抗氧化基因如过氧化氢酶(CAT)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的表达，从而减轻氧化损伤[14]。本实验结果显示，胆道梗阻后(B组)PPARα蛋白表达下降、ALT水平升高，胆道再通后(C组)PPARα蛋白表达升高、ALT水平降低，胆道再通同时予以白藜芦醇干预后(D组)PPARα蛋白表达进一步升高、ALT水平进一步降低。说明白藜芦醇能激活PPARα表达，减轻胆道再通大鼠肝脏氧化损伤，保护肝功能。

综上所述，白藜芦醇可能通过激活SIRT1抑制NF-κB，发挥抗炎、抗凋亡作用，通过促进PPARα的表达发挥抗氧化作用，从而减轻胆道梗阻再通大鼠的肝脏损害，促进肝功能恢复。

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Protective effect of resveratrol on liver injury in rats after

recanalization of biliary obstruction

XU Chao-long,WU Shan-min,MIAO Zhi-zhao,et al

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan，Hubei430060,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the protective effect of resveratrol (Res) on liver injury in rats after recanalization of biliary obstruction. Methods Sixty healthy male Wistar rats were randomized into four groups: sham group (group A), obstructive jaundice one week group (group B), obstructive jaundice one week and recanalization one week+NS group (group C), obstructive jaundice one week and recanalization one week+Res group (group D). The levels of total bilirubin(TBIL),direct bilirubin(DBIL) and serum alanine aminotransferase(ALT) were measured. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to determine the mRNA expression of silent information regulator 1(SIRT1). The expression of the SIRT1 and nuclear factor-κB (NF-κB) proteins were detected by Western blot. Immunocytochemical assay was performed to examine peroxisome proliferator activated receptor-alpha (PPARα) protein. Hepatocellular apoptosis was examined by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) method. Results Compared with group A, in group B the level of ALT was higher, the expressions of SIRT1 mRNA and protein and the PPARα protein were lower, and the NF-κB protein and the rate of hepatocellular apoptosis were higher(P<0.05). Compared with group B, in group C the level of ALT was lower, the expression of SIRT1 mRNA and protein and the PPARα protein were higher, and the NF-κB protein and the rate of hepatocellular apoptosis were lower(P<0.05). Compared with group C, in group D the level of ALT was lower, the expressions of SIRT1 mRNA and protein and the PPARα protein were higher, and the NF-κB protein and the rate of hepatocellular apoptosis were lower(P<0.05).Conclusion The Res could resist inflammation and apoptosis by activating the SIRT1 which probably inhibits the expression of NF-κB protein, and palys an antioxidant role by promoting the expression of PPARα in rats after recanalization of biliary obstruction, so that it could alleviate liver damage.

Key words：resveratrol;obstructive jaundice;recanalization;SIRT1;PPARα;NF-κB

收稿日期：(2015-09-09，修回日期：2015-10-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.008

通信作者：邬善敏，男，教授，硕士生导师，研究方向：肝胆外科基础与临床，E-mail：15327278328@163.com