贵州不同产地苦参生物总碱和总黄酮的含量比较

陆平祝， 龙庆德， 常楚瑞， 彭建端， 金 燕， 王晓丽

(贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004)

贵州不同产地苦参生物总碱和总黄酮的含量比较

陆平祝， 龙庆德， 常楚瑞*， 彭建端， 金 燕， 王晓丽

(贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004)

为黔产苦参资源的保护利用提供依据，采用紫外分光光度法对贵州不同产地苦参的生物总碱和总黄酮的含量进行研究。结果表明：不同产地苦参有效成分含量的差异较大。其中，以毕节市大方县和铜仁市思南县的苦参生物碱含量最高，分别达15.6%和15.2%，明显高于其他产地的苦参；六盘水市老鹰山的苦参总黄酮含量最高，为15.7%。

苦参； 生物总碱； 总黄酮； 紫外分光光度法； 贵州

苦参(Sophoraflavescensvar.flavescens)为豆科槐属植物[1]，落叶亚灌木，10月掘取根部，干燥入药；常见于沙地、山坡、灌丛和草地，全国各地广泛分布，现贵州多地有野生种和栽培种。其干燥根始载于《神农本草经》，主要化学成分为喹嗪啶类生物碱和异戊烯基黄酮类[2-3]，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功效。目前，国内外对苦参的研究主要侧重于苦参药材及其复方制剂在抗肿瘤、抗病毒和抗感染等以及其质量评价方面，并已形成妇科洗液、苦参针剂和苦参注射液等医药制剂[4-8]。随着苦参用途的不断增加，苦参原料的用量逐年增长[9]。苦参药材生物总碱和总黄酮的含量与生长环境有密切关系[10]。为此，笔者于2015年对贵州不同产地苦参的生物总碱和总黄酮的含量进行比较研究，以期为保护野生苦参资源，寻找适合苦参种植的基地，为贵州苦参种植产业的发展及其资源综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 苦参药材 采挖于贵州省21个不同区域(表1)。经贵州医科大学药用植物学与生药学教研室鉴定为苦参(S.flavercensAit.)的根。

1.1.2 试剂 苦参碱标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110780-201007110805-200508)，芦丁标准品(上海源叶生物科技有限公司，批号:Y05M6S1)，溴麝香草酚蓝磷酸氢二钠缓冲溶液，芦丁、浓氨、三氯甲烷、醋酸钾(KAC)和乙醇，均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备 METTLER TOLEDO电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，AS系列超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司，250 W，100 kHZ)，Q-250B高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)，UV-5800PC型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)，HH-Z数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)，DROGON移液枪(上海恒奇仪器有限公司)。

1.2 材料预处理

1.2.1 标准溶液的制备 精密取苦参碱标准品5 mg，加入25 mL容量瓶中，加无水乙醇25 mL，制成0.2 g/L的苦参碱标准溶液；取芦丁标准品5 mg，用 60%乙醇超声溶解并定容至25 mL，得浓度为0.2 g/L的芦丁标准溶液。

表1 贵州不同产地苦参材料的来源

Table 1 The source ofS.flaescensfrom different regions in Guizhou

编号No．产地Site纬度E/°Latitude经度N/°Longitude1铜仁市德江县N28°15′E108°05′2贵阳市龙洞堡N26°34′E106°46′3修文县扎佐镇N26°51′E106°42′4凯里市香炉山N26°36′E107°53′5麻江县下司镇N26°36′E107°58′6遵义市余庆县N27°13′E107°53′7贵阳市二戈寨N26°30′E106°43′8贵阳市世纪城N26°36′E106°37′9贵阳市水田镇N26°44′E106°49′10兴仁县百德镇N25°41′E105°26′11开阳县南江乡N26°56′E106°58′12清镇市百花湖N26°41′E106°31′13花溪区孟关乡N26°24′E106°44′14黔南州龙里县N26°27′E106°58′15贵阳市大转弯N26°49′E106°12′16六盘水老鹰山N26°33′E105°01′17毕节市大方县N27°08′E105°36′18安顺市平坝县N26°24′E106°16′19铜仁市思南县N27°40′E107°59′20贵阳市花溪区N26°23′E106°37′21黎平县高屯镇N26°20′E109°09′

1.2.2 苦参生物总碱提取 参照文献[12-13]的方法提取。将贵州不同产地的苦参干燥根粉碎，过3号筛(60目)，精密称取约0.3 g加入具塞锥形瓶中，精密加入浓氨试液0.5 mL，然后加入三氯甲烷20 mL，塞上塞子，称重并记录，超声波处理30 min，功率250 W，频率33 kHz，待冷却至室温，称其重量，再用三氯甲烷补足失重，摇匀，过滤，放入冰箱保存待用。

1.2.3 苦参总黄酮的提取 称取1 g苦参根粉末，采用80%的乙醇约25.5 mL(固液比为1∶25)，超声处理60 min，功率100 W，待冷却至室温，离心，取上清液，用80%乙醇定容至25 mL，摇匀即得。

1.3 最大波长的选择

1.3.1 苦参生物总碱 微量加样枪吸取苦参碱标准溶液100 μL分别加入25 mL具塞试管中，水浴蒸干溶液后，加入溴麝香草酚蓝磷酸氢二钠缓冲溶液6 mL(pH 7.6) ，再精密加入三氯甲烷6 mL，塞上塞子剧烈振摇2 min，放置30 min，使水层和三氯甲烷层完全分层，弃上清液；以溴麝香草酚蓝磷酸氢二钠缓冲溶液6 mL+三氯甲烷6 mL为对照(CK)。采用紫外分光光度计在200～800 nm进行扫描，选择标准品溶液呈最大吸收值的波长作为含量测定波长。

1.3.2 苦参总黄酮 参照文献[14-17]的方法测定。精密吸取4 mL芦丁标准溶液置于50 mL容量瓶中，先后加入4.0 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和5.0 mL 1.0 mol/L KAc 溶液，再加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置40 min；以4.0 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和5.0 mL 1.0 mol/L KAc 为空白对照(CK)。采用紫外分光光度计在200～800 nm波长进行扫描，选择标准品溶液呈最大吸收值的波长作为含量测定波长。

1.4 苦参生物总碱与总黄酮含量的测定

1.4.1 线性关系考察 1) 苦参生物总碱。用微量进样器精密吸取苦参碱标准液0 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL和300 μL分别加入25 mL具塞试管中，用1.3.1方法测定其吸光度，求出苦参总碱浓度(y1)与吸光度(x1)关系曲线的回归方程。2) 苦参总黄酮。精密吸取芦丁标准液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL分别置于50 mL 容量瓶中，用1.3.2方法测定其吸光度，求出苦参总黄酮含量(y2)与吸光度(x2)关系曲线的回归方程。并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线见图2。

1.4.2 精密度试验 分别取苦参碱标准液100 μL加到5个25 mL具塞试管中，用1.3.1方法测定其吸光度，5次重复；取芦丁标准品溶液4 mL，用1.3.2方法测定其吸光度，6次重复。

1.4.3 重复性试验 称量0.3 g苦参粉末，共6份，用1.2.2方法提取苦参生物总碱，用1.3.1方法测定其吸光度。称量1 g苦参粉末，共6份，用1.2.3方法提取苦参生物总碱，用1.3.2方法测定其吸光度。

1.4.4 稳定性试验 分别吸取苦参生物总碱、总黄酮供试品溶液，每隔30 min测定1次，持续4 h；精密吸取苦参总黄酮一供试品溶液，每隔30 min测定1次，持续3 h。

1.4.5 加样回收率试验 分别称取已知含量的苦参总碱和苦参总黄酮提取物各9份，约0.3 g和1 g，分别加入标准品适量。用1.3.1和1.3.2的方法进行测定其吸光度，计算其含量及回收率。

2 结果与分析

2.1 苦参生物总碱和总黄酮含量与吸光度的相关性及波长测定

从图1可知，根据试验结果拟合得到苦参总碱含量(y1)与吸光度(x1)在2.55～6.8 μg/mL存在良好的线性关系，其回归方程为y1=0.094 7x1-0.001 8，相关系数R2=0.999 8；苦参总黄酮含量(y2)与吸光度(x2)在8～24 μg/mL存在良好的线性关系，其回归方程为y2=0.029 0x2-0.009 4，R2=0.999 1。

从图2可知，苦参生物总碱最大吸收值对应的波长为413 nm，苦参总黄酮最大吸收值对应的波长为420 nm，因此，分别选择413 nm和510 nm作为苦参生物总碱和苦参总黄酮含量的测定波长。

2.2 回收率与精密度

经测定：苦参生物总碱标准液的相对标准偏差RSD精密度=0.68%，芦丁标准液的RSD精密度=0.76%。苦参药材生物总碱的平均含量为0.36%，RSD重复性=0.62%；其总黄酮平均含量为4.66%，RSD重复性=0.80%。苦参药材生物总碱和苦参总黄酮的平均含量稳定，其提取液的平均含量分别为4.09%(4 h内，RSD稳定性=1.0%)和4.98%(3 h内，RSD稳定性=1.38%)。从表2可知：苦参生物总碱提取物的加样回收率在95.68%～99.28%，平均为97.23%，RSD=1.10%；总黄酮的加样回收率在95.41%～99.24%，平均为96.50%，RSD=1.16%。说明，回收率符合含量测定要求。

图1 苦参总碱和芦丁的标准曲线

Fig.1 Matrine standard curve and rutin Standard curve

图2 苦参碱和芦丁标准品的吸收光谱

Fig.2 Reference substance wavelength scanning matrine and rutin

表2 苦参药材提取物的加样回收率

注：*表示苦参总黄酮的样品中含量、标准品加入量和测得量的单位为mg。

Note: * represented the content of sophora alkaloids in sample. Unit for adding amount of standard substance and measured value was mg.

2.3 贵州不同产地苦参生物总碱和总黄酮的含量

从表3可知，21个产地的苦参生物总碱和总黄酮含量差别较大。产于毕节市大方县和铜仁思南县苦参干燥根的生物总碱含量分别为15.6%和15.2%，明显高于其他产地；六盘水市苦参干燥根的生物总碱含量最低，为1.58%，但其苦参总黄酮含量最高，为15.7%。建议苦参药材培育基地的选择可根据自身需求定。

表3 贵州不同产地苦参的生物总碱和总黄酮含量

3 结论与讨论

利用紫外分光度法测定苦参药材生物总碱和总黄酮含量的方法简单、可靠。试验结果表明，不同产地黔产苦参有效成分含量的差异较大，其中，以毕节市大方县和铜仁市思南县的苦参生物碱含量最高，分别达15.6%和15.2%，明显高于其他产地的苦参；六盘水市老鹰山的苦参总黄酮含量最高，为15.7%。

目前，贵州多地有野生苦参和栽培品，该试验较全面地反映不同产地黔产苦参生物总碱和总黄酮的含量状况存在较大差异。说明，黔产苦参生物总碱和总黄酮含量的区域性较强。近几年，苦参原药的需求逐步增大，因此，应选择适宜苦参种植区域栽培以提高产量。如何确定苦参药材的药源基地，有待于进一步研究。

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(责任编辑： 王 海)

Comparative Study on Contents ofSophoraAlkaloids and Flavonoids from Different Habitats of Guizhou

LU Pingzhu, LONG Qingde， CHANG Churui*, PENG Jianduan, JIN Yan, WANG Xiaoli

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

To provide basis for protection and utilization ofS.flavescensresources in Guizhou, UV spectrophotometry was employed to analyze the contents of sophora alkaloids and flavonoids from different habitats of Guizhou. Results: Active ingredient concentration ofS.flavescensvaried greatly from different habitats. Sophora alkaloids content were the highest from Dafang County of Bijie City and Sinan County of Tongren City, respectively 15.6% and 15.2%, significantly higher than that from other habitats. Flavonoids from Laoyingshan of Liupanshui City was the highest, which was 15.7%.

Sophoraflavescens; alkaloids; flavonoids; UV spectrophotometry; Guizhou

2015-10-23； 2016-04-25修回

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项“黔产大宗药材金樱子、苦参质量评价研究”[黔科合ZY字(2012)3004]，“贵州省15种重点发展药材的加工炮制技术集成及产业应用”[黔科合重大专项字(2015)6009-2]

陆平祝(1990-)，女，在读硕士，研究方向：生药学。E-mail: 1435962566@qq. com

*通讯作者：常楚瑞(1973-)，女，副教授，博士，从事生药学及中草药研发工作。E-mail：changchurui@hotmail.com

1001-3601(2016)05-0218-0120-04

S567.5+3

A