复方一枝蒿微丸抗炎、免疫及抗菌作用研究

陈　蕾，姜　雯，潘晓梅，刘婕妤，邢建国

(1新疆维吾尔自治区卫生与计划生育委员会药品采购中心，乌鲁木齐　830000； 2新疆医科大学第六附属医院药剂科，乌鲁木齐　830002；

3新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐　830004)



复方一枝蒿微丸抗炎、免疫及抗菌作用研究

陈蕾1，姜雯2，潘晓梅2，刘婕妤2，邢建国3

(1新疆维吾尔自治区卫生与计划生育委员会药品采购中心，乌鲁木齐830000；2新疆医科大学第六附属医院药剂科，乌鲁木齐830002；

3新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐830004)

摘要：目的探讨复方一枝蒿微丸的抗炎、免疫及体内外抗菌作用。方法采用小鼠耳廓肿胀和毛细血管通透性试验观察复方一枝蒿微丸的抗炎作用；检测其对SRBC免疫小鼠血清中IgM生成的影响，以及对LPS及ConA诱导下T、B淋巴细胞增殖作用的影响；测定其对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌的体外抗菌作用，并观察其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌感染小鼠死亡的保护作用。结果复方一枝蒿微丸低、中、高(0.5、1.0、2.0 g/kg)剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和腹腔毛细血管通透性升高均有显著的抑制作用；可显著升高SRBC免疫小鼠血清IgM水平；在232～15 000 μg/mL浓度范围内，能显著抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖作用(P<0.05)；在464～15 000 μg/mL浓度范围内，能显著抑制LPS诱导的B淋巴细胞增殖作用(P<0.05)；1.0 g/mL的复方一枝蒿微丸对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌抑菌圈直径分别为1.65、1.38 mm，MIC分别为62.5、6.4 mg/mL，MBC分别为125.0、12.5 mg/mL，且能显著降低金黄色葡萄球菌、大肠杆菌感染小鼠的死亡率(P<0.05)。结论复方一枝蒿微丸具有一定的抗炎、抗菌和调节免疫功能的作用。

关键词：复方一枝蒿微丸； 抗炎； 免疫； 抗菌

一枝蒿(Artemsia rupestris L.)为菊科蒿属植物，是新疆地产药材，是维吾尔医常用药，临床用于治疗热性感冒、发热、头痛、胃痛、腹胀、肝炎、荨麻疹、毒虫咬伤等[1-2]。复方一枝蒿处方是以一枝蒿为君药，加上板蓝根、大青叶组成的复方，主要用于治疗邪毒所致的感冒发烧、咽喉肿痛、病毒性感冒，疗效确切[3]，是维吾尔药特色品种。本课题组对复方一枝蒿进行了二次开发研究，采用热熔挤出技术研制成中药新剂型-微丸[4]。本研究观察复方一枝蒿对小鼠急性炎症模型、小鼠血清IgM水平、T淋巴细胞增殖作用的影响，以及对小鼠体内外抗菌试验，评价复方一枝蒿微丸的抗炎、抗菌和对免疫功能的作用，为临床应用提供依据。

1仪器与试药

1.1实验仪器SW-CT-IF 净化工作台(苏净安泰空气技术有限公司)，GMXS-280 型手提式压力蒸汽消毒器(上海博迅实业有限公司医疗仪器厂)，恒温生化培养箱(上海福玛设备有限公司)，SIM-SIR 独立换气系统笼具(上海邵峰实验动物设备有限公司)，550酶标仪(BIO-RAD)，722 分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

1.2实验药物受试药：复方一枝蒿微丸(新疆药物研究所自制，批号20140118)，临床剂量为2.5 g/袋，1袋/次，3次/d；对照药：抗病毒颗粒(四川光大制药有限公司，批号1312466)，临床剂量为12 g/袋，1袋/次，3次/d；复方一枝蒿颗粒(新疆银夺兰维药股份有限公司，批号140212)，临床剂量为5 g/袋，1袋/次，3次/ d。

1.3实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，购自于新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，动物生产许可证号：SCXK(新)2011-0001。

1.4实验菌株金黄色葡萄球菌(批号ATCC 25923)，肺炎链球菌(批号D240)，大肠杆菌(批号ATCC 25922)，实验菌株均由中国药品生物制品鉴定所提供。

1.5试剂二甲苯(西安化学试剂厂，批号130704)，MH肉汤培养基(杭州天和微生物试剂有限公司，批号2013919)，伊文思蓝(西安化学试剂厂，批号130613)，营养琼脂培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20140116)，ConA(TBD公司，批号C-2013)，血琼脂培养基(上海康润生物科技有限公司，批号20140908)，冰醋酸(西安化学试剂厂，批号20131205)，LPS(Sigma公司，批号130122)， Mouse IgM ELISA试剂盒(R&D公司，批号201309)，羊血(采自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心)。

2方法与结果

2.1抗炎作用

2.1.1对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响[5-6]取昆明种小鼠，雌雄各半，按体质量随机分为模型组、抗病毒颗粒组(4.6 g/kg)、复方一枝蒿颗粒组(2.0 g/kg)、复方一枝蒿微丸低、中、高(0.5、1.0、2.0 g/kg)剂量组，灌胃给药，1次/d，模型组灌胃等体积蒸馏水，连续5 d，末次给药1.5 h后，以左耳作空白对照，用二甲苯致炎，30 min后处死，在左、右耳对称部位打下耳片，计算肿胀度和肿胀抑制率。结果显示，与模型组比较，复方一枝蒿颗粒、抗病毒颗粒对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显抑制作用(P<0.05)，一枝蒿微丸不同剂量对二甲苯致小鼠耳肿胀均有明显抑制作用(P<0.01)，且对耳肿胀抑制的作用伴有浓度依赖性，临床用量的复方一枝蒿微丸抑制作用优于抗病毒颗粒和复方一枝蒿颗粒，见表1。

表1　对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(±s， n=10)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.1.2对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响[7]动物、分组、剂量及给药同耳廓肿胀实验，末次给药1.5 h后，尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液10 mL/kg，立即腹腔注射 0.6%冰醋酸0.2 mL/只。15 min后处死，用6 mL生理盐水溶液反复冲洗腹腔，吸出冲洗液，离心，测定吸光度(590 nm)，计算炎性渗出抑制率:抑制率(%)=(对照组OD590-给药组OD590)/对照组OD590×100%。结果显示，与模型组比较，抗病毒颗粒、复方一枝蒿颗粒及复方一枝蒿微丸不同剂量均可显著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的增高(P<0.01)，且一枝蒿微丸的抑制作用具有浓度依赖性，其临床用量对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的抑制作用要优于抗病毒颗粒和复方一枝蒿颗粒，结果见表2。

表2　对冰醋酸致小鼠炎性渗出的影响(±s， n=10)

注：与模型组比较，**P<0.01。

2.2免疫作用[8-9]

2.2.1对小鼠IgM生成的影响在无菌条件下，静脉取50 mL羊血，置无菌锥形瓶(放有玻璃球)中，震摇10 min，加2倍体积的阿氏液(Alsever)液，摇匀后即得绵羊红细胞，放入冰箱(4 ℃)备用。用时用生理盐水冲洗3次，离心，弃上清液，用生理盐水3∶5(V/V)稀释，细胞计数为2×109个/mL。取70只昆明种小鼠(体质量18～20 g)，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、抗病毒颗粒组(4.6 g/kg)、复方一枝蒿颗粒组(2.0 g/kg)及复方一枝蒿微丸低、中、高(0.5、1.0、2.0 g/kg)剂量组，空白对照组及模型组灌胃等量蒸馏水，其余组给予相应制剂，连续3 d，末次给药时，除空白对照组外，其余各组腹腔注射绵羊红细胞0.2 mL/只，2 h后眼眶取血分离血清，测定血清中IgM的含量。结果显示，与空白对照组比较，模型组血清中IgM抗体水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，抗病毒颗粒、复方一枝蒿颗粒组小鼠血清中IgM抗体水平显著升高(P<0.01)；复方一枝蒿微丸3个剂量小鼠血清IgM抗体水平均显著升高(P<0.01)，见表3。

表3　对小鼠IgM生成的影响(±s， n=10)

注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

2.2.2对小鼠T和B淋巴细胞增殖作用的影响

2.2.2.1对小鼠B淋巴细胞增殖的影响无菌取BALB/C小鼠脾脏，用0～4℃生理盐水清洗，剔除脂肪及结缔组织，剪碎，100目筛网过滤，收集细胞液，离心，弃上清，经低渗的0～4℃ 0.8%NH4Cl溶液处理2～3次以除去红细胞，再以0～4℃生理盐水液洗2次，用Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养液将细胞浓度调至1×107/mL。设细胞对照孔、LPS+细胞对照孔及抗病毒颗粒20 000、10 000、5 000、2 500、1 250、625、312 μg/mL等不同浓度孔，设复方一枝蒿颗粒浸膏粉和复方一枝蒿微丸浸膏粉15 000、7 500、3 750、1 875、937、464、232 μg/mL等不同浓度孔，样品及LPS(终浓度8 μg/mL)均以超纯水配成所需浓度，每个浓度设4孔，于96孔板加样。培养板置37℃、5% CO2培养48 h后取出，10 μL/孔加MTT混匀后再培养4 h，吸弃上清，加二甲基亚砜(100 μL/孔)，稍振荡使甲臜产物充分溶解，在波长570 nm处用酶标仪测定各孔OD值。

2.2.2.2对小鼠T淋巴细胞增殖的影响按“2.2.2.1”项下方法配置，样品及ConA(终浓度8 μg/mL)以超纯水配成所需浓度，每个浓度设4孔，于96孔板样。培养板置37℃、5 %CO2条件培养48 h后取出，加MTT(10 μL/孔)混匀后再培养4 h，吸弃上清，加二甲基亚砜(100 μL/孔)，稍振荡使甲臜产物充分溶解，用酶标仪测定各孔OD值。

2.2.3对小鼠T和B淋巴细胞增殖作用影响的结果与ConA/LPS对照组比较，复方一枝蒿颗粒在给药浓度范围内吸光度值显著降低(P<0.05)；抗病毒颗粒在给药浓度范围内吸光度值显著降低(P<0.01)；复方一枝蒿微丸在给药浓度范围内吸光度值显著降低(P<0.05)，并具有浓度剂量相关性。与LPS组比较，抗病毒颗粒浓度(20 000 μg/mL)吸光度值显著降低(P<0.01)；在464～15 000 μg/mL范围内一枝蒿颗粒对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有抑制作用；在464～15 000 μg/mL浓度范围内复方一枝蒿微丸可抑制LPS诱导的B淋巴细胞增殖,见表4。

2.3 体外抑菌作用

2.3.1菌悬液的制备[10]将金黄色葡萄球菌接种于MH肉汤培养基中，肺炎链球菌接种于血清MH肉汤培养基中，置温箱中37 ℃恒温培养6 h,计算活菌数。计数结果：金黄色葡萄球菌为1.7×107CFU/mL，肺炎链球菌为2.67×105CFU/mL，置4 ℃冰箱保存备用。

2.3.2纸片扩散法测定抑菌强度[10]将滤纸(厚度为1 mm)用打孔器制成圆形纸片，灭菌、烘干，放到抗病毒颗粒、复方一枝蒿颗粒及微丸药液(浓度均为1 000 mg/mL)中浸泡过夜，放入无菌平皿烘干备用。用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于琼脂平板表面，将药敏纸片贴于平板上，每平板帖3个药敏纸片，预扩散15 min，然后倒置在培养箱中37 ℃培养24 h，每种药物设3个重复。测量各药敏纸片的抑菌环直径，根据抑菌环直径大小判定药物抑菌效果。结果浓度为1 000 mg/mL的抗病毒颗粒对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为0.7 mm，对肺炎链球菌没有观测到抑菌圈。浓度为1 000 mg/mL的复方一枝蒿颗粒对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为0.99 mm，对肺炎链球菌抑菌圈直径为0.79 mm。浓度为1 000 mg/mL的复方一枝蒿微丸对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为1.65 mm，对肺炎链球菌抑菌圈直径为1.38 mm。

表4　复方一枝蒿微丸对T和B淋巴细胞增殖作用的影响(±s， n=4)

注：n表示复孔数，与细胞对照组比较，##P<0.01；与ConA/LPS对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

2.3.3试管二倍稀释法测定抑菌效价[10]取13支无菌小试管，编号1～13，第1管中加入药液1.8 mL，第2～13管每管加0.9 mL灭菌的普通肉汤培养基，第1管混匀后吸取0.9 mL药液移至第2管，第2管混匀后吸取0.9 mL至第3管，连续倍比稀释至第l0管，第10管混匀后弃去0.9 mL；倍比稀释后，第1～10管每管加入0.1 mL实验菌，第11管不加药液和菌液作为空白对照；第12管加入药液0.1 mL，不加细菌，观察受试药物是否有污染；第13管不加药液，加入0.1 mL菌液，观察细菌生长情况。肺炎链球菌采用血清肉汤稀释。第1～10管、13管中各加入0.1 mL稀释菌液，混匀，37 ℃培养箱培养24 h。肉眼观察，与第12、13管比较，不发生混浊变化的最高药物稀释倍数为该药物的最小抑菌浓度值(MIC)。将所有肉眼观察清晰的试管培养液接种于M-H琼脂平板培养24 h，以菌落数<5个的最低药物浓度为该药物的最小杀菌浓度值(MBC)。结果空白对照管液体为澄清，只含有菌液的阳性对照管液体呈现为浑浊，含有系列浓度的复方一枝蒿微丸试管，按照浓度从高到低，液体由澄清到浑浊。最后得出复方一枝蒿微丸对金黄色葡萄球菌的MIC为62.5 mg/mL，MBC为125.0 mg/mL；对肺炎链球菌的MIC为6.4mg/mL，MBC为12.5 mg/mL，见表5、6。

表5　复方一枝蒿微丸外抗菌作用实验结果(试管法)

注：+：接种平板后有菌生长， -：接种平饭后无菌生长 ， △：MIC， #：MBC。

表6对2种病原菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)/(mg/mL)

金黄色葡萄球菌MICMBC肺炎链球菌MICMBC抗病毒颗粒62.5125.062.5125.0复方一枝蒿颗粒62.5125.07.815.6复方一枝蒿微丸62.5125.06.412.5

2.4体内抗菌作用[10-11]

2.4.1感染菌液的配制将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌置于肉汤培养6 h，离心，沉淀，以无菌生理盐水稀释供腹腔注射染菌用。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌体内实验浓度经预试验确定为能引起小鼠腹腔注射菌液(0.5 mL/20 g)后48 h内引起90%动物死亡的浓度分别为1.3×1010CFU/mL和1.25×1012CFU/mL。

2.4.2对细菌感染小鼠死亡数的影响昆明种小鼠60只，雌、雄各半，每组10只，按“2.1.1”项下方法分组给药，连续给药5 d，于第5 天给药1.5 h后，以稀释菌液的90%最小致死剂量感染各组小鼠，0.25 mL/10 g，感染后6 h给药1次，观察并记录48 h内小鼠死亡情况，记录死亡时间，计算死亡保护率。死亡保护率(%)=(模型对照组死亡率-实验组死亡率)/模型对照组死亡率×100%。结果：模型对照组感染菌后，随之即出现死亡，精神活动状态差，采食饮水较少，48 h死亡率为90%。抗病毒颗粒与复方一枝蒿颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌感染小鼠死亡均有一定的保护作用，见表7、8。

表7　对金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡保护率

表8　对大肠杆菌感染小鼠的死亡保护率

3讨论

流感病毒首先侵入人体的呼吸道上皮组织并增殖，引起细胞变性并进一步扩散感染，引起上呼吸道急性或亚急性炎症。观察抗流感药物的药理作用，应以主症发病初期炎症渗出、肿胀和白细胞游走等急性炎症过程为主要试验指标。本研究以二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性为模型，评价一枝蒿微丸对急性、亚急性炎症的抑制作用。结果表明，复方一枝蒿微丸可明显抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀和冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性，且有一定剂量关系。复方一枝蒿微丸能显著升高SRBC免疫小鼠血清IgM抗体水平，对ConA诱导的T淋巴细胞增殖和LPS诱导的B淋巴细胞增殖具有显著抑制作用。表明一枝蒿微丸对T淋巴细胞介导的细胞免疫与B淋巴细胞介导的体液免疫具有辅助作用，从而增强机体的特异性免疫反应。复方一枝蒿微丸对金葡菌和肺炎链球菌有明显的抑制作用，其中对肺炎链球菌的抑制作用较好，且对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌感染小鼠死亡均具有较好保护作用。综上，复方一枝蒿微丸具有一定的抗炎免疫和抗菌作用。

参考文献:

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(本文编辑施洋)

The research of compound Yizhihao pellets on antibacterial， immune function and anti-inflammatory

CHEN Lei1, JIANG Wen2, PAN Xiaomei2, LIU Jieyu2, XING Jianguo3

(1CenterforDrugProcurementofHealthandFamilyPlanningCommissionoftheAutonomousRegion，

Urumqi830000,China；2DepartmentofPharmacy，TheSixthAffiliatedHospitalofXinjiangMedical

University，Urumqi830002,China；3XinjiangInstituteofMateriaMedica,Urumqi830004,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory, immune and antibacterial effects in vitro and in vivo of the compound Yizhihao pellets. MethodsThe anti-inflammatory effect of compound Yizhihao pellets was observed through the ear edema and capillary permeability in mice. Impact of generated of IgM of SRBC immune mice in the serum and proliferation effect of LPS and ConA induced T, B cell was measured. The antibacterial effect of compound Yizhihao pellets on Staphylococcus aureus, streptococcus pneumonia in vitro was detected. Evaluation of the immune effect in mice against Staphylococcus aureus, Escherichia coli challenge. ResultsCompound Yizhihao pellets dosage (0.5, 1, 2 g/kg) could significantly inhibit ear edema and capillary permeability increase in mice model and increase IgM level of SRBC immunized mice in the serum. It could significantly inhibit the proliferation of T cells induced by ConA (P<0.05) at 232~15 000 μg/mL and inhibit the proliferation of B cells induced by LPS (P<0.05)at 464~15 000 μg/mL. When concentration of Compound Yizhihao pellets was 1.0 g/mL, diameter of bacteriostatic ring of Staphylococcus bacteria and Streptococcus pneumoniae were 1.65 mm and 1.38 mm, MIC were 62.5, 6.4 mg/mL, MBC were 125.0, 12.5 mg/mL, and it could significantly reduce the mortality of mice infected with Staphylococcus aureus and Escherichia coli (P<0.05). ConclusionCompound Yizhihao pellets has certain effects of anti-inflammatory, antibacterial and regulating immune function.

Keywords:compound Yizhihao pellets; antiinflammatory; immune; antibiosis

[收稿日期：2015-11-1]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.012

中图分类号：R914

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)02-0179-05

作者简介：陈蕾(1980-)，女，硕士，副主任药师，研究方向:中药新药研究。通信作者：邢建国，男，硕士，研究方向:新药研究与开发，E-mail：xjguodd@163.com。

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C136)