石榴皮中活性成分鞣花酸的平衡溶解度与油水分配系数的测定

施　洋，孙　芸，谢　莉，田　莉

(新疆医科大学1学报编辑部, 2中医学院, 3新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐　830011)



石榴皮中活性成分鞣花酸的平衡溶解度与油水分配系数的测定

施洋1,2，孙芸2,3，谢莉2，田莉2,3

(新疆医科大学1学报编辑部,2中医学院,3新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐830011)

摘要：目的考察鞣花酸在25℃和37℃下不同 pH 磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度与表观油水分配系数(Papp)。方法采用紫外-可见分光光度法测定鞣花酸在不同 pH 缓冲液中的平衡溶解度；采用摇瓶法测定鞣花酸的Papp值。结果25℃时鞣花酸在pH值为1.2、2.5、5.0、5.8、6.8、7.4、7.8~8.0的磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度分别为2.77、4.97、8.14、6.16、1.22、1.33、1.01 g/mL，相应条件下Papp值分别为-3.20、-2.36、-2.49、-2.50、-2.48、-2.37、-2.22；37℃时鞣花酸在上述pH 缓冲液中的平衡溶解度为3.25、5.08、8.04、6.39、1.02、1.54、1.14 g/mL，相应条件下的Papp值分别为-2.38、-2.32、-2.38、-2.41、-2.44、-2.38、-2.18。结论鞣花酸在酸性溶液中的平衡溶解度随pH值的升高而增大，在中性及弱碱性溶液中其溶解度较小。在pH值为1.2～8.0时，鞣花酸的Papp值均<-2，表明鞣花酸不易透过生物膜，推测其在胃肠道的吸收不好，且温度对鞣花酸的Papp值几乎无影响。

关键词：鞣花酸；平衡溶解度；表观油水分配系数

鞣花酸是石榴皮中的主要多酚类成分，属于没食子酸的二聚体衍生物，化学名为联二没食子酸内酯，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗诱变、抗癌变等作用，被广泛应用于医疗、化妆品、食品等领域[1-2]。药物在细胞膜的渗透性与药物的亲脂性有密切的关系，直接影响药物吸收的速度和程度，其中药物的油水分配系数和平衡溶解度是反映药物脂溶性不可缺少的2个重要理化参数，对研究药物的体内过程具有重要的意义[3]。鞣花酸微溶于水、醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚[4]，目前对其在不同 pH 值缓冲液中理化常数的测定未见报道。本研究对鞣花酸在不同 pH值磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度以及在正辛醇/磷酸盐缓冲液体系中的油水分配系数进行考察，为估计该药物透过生物膜的能力以及剂型设计提供实验依据。

1仪器与试药

752型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，PHSJ-3F pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，DKZ型系列恒温振荡浴槽(上海恒科学仪器有限公司)，鞣花酸对照品(成都曼思特生物科技有限公司；生产批号：R-004-140731；HPLC≥98%)，甲醇为色谱级，二甲基亚砜(DMSO)和磷酸(sigma公司)，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1溶液的配制

2.1.1磷酸盐缓冲液按《中国药典》方法[5]分别配制pH为1.2、2.5、5.8、6.8、7.4、7.8～8.0的磷酸盐缓冲液，用精密pH计测定，若有偏离，用0.1 mol/L的HCl或0.2 mol/L的NaOH校正至所需数值。

2.1.2正辛醇饱和水溶液的制备用量筒量取150 mL蒸馏水与50 mL正辛醇于具塞三角瓶中，恒温振荡24 h，使二者相互饱和，静置，分层后用分液漏斗分离，保存备用。上层为被水饱和的正辛醇，下层为被正辛醇饱和的水。

2.1.3鞣花酸储备液精密称取鞣花酸对照品适量，加入少量二甲基亚砜(DMSO)溶解，再用甲醇定容至100 mL，得105.0 μg/mL鞣花酸对照品储备液，4℃保存。

2.1.4鞣花酸正辛醇溶液的配制精密称取适量鞣花酸原料药溶解于被水饱和的正辛醇中，制备鞣花酸的正辛醇溶液。

2.2平衡溶解度的测定

2.2.1最大吸收波长的确定取鞣花酸标准溶液适量，于200～800 nm进行紫外可见光扫描。结果表明，鞣花酸最大紫外吸收波长为254 nm，故选用254 nm作为鞣花酸的最大紫外吸收波长，见图1。

图1　鞣花酸的最大吸收波长

2.2.2标准曲线的制备分别精密移取鞣花酸对照溶液0.12、0.17、0.22、0.27、0.32、0.37、0.42 mL于10 mL容量瓶中，分别加入“2.1.1”项下不同pH值缓冲溶液稀释定容至刻度，得到质量浓度为1.260、1.785、2.310、2.835、3.360、3.885、4.410 μg/mL的鞣花酸系列标准溶液。紫外-可见分光光度法分别测定室温25℃和体温37℃条件下不同pH值缓冲溶液的A值，以质量浓度C(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标进行线性回归，各回归方程在1.260~4.410 μg/mL范围内，均有r>0.99，表明线性关系良好，见表1。

2.2.3精密度试验分别精密吸取鞣花酸储备液0.10、0.17、0.27 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，得到质量浓度为1.050、1.785、2.835 μg/mL的鞣花酸对照液。分别取不同浓度对照液在254 nm处测定吸光度，连续测定5次。结果低、中、高质量浓度溶液的吸光度RSD值分别为0.745%、0.871%、0.429%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.2.4稳定性试验分别取高、中、低浓度的鞣花酸标准品液各5份，分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24 h后按上述方法测定吸光度。结果低、中、高不同质量浓度的鞣花酸标准品液的RSD平均值分别为5.27%，2.150%，0.972%(n=5)，表明鞣花酸标准品液于室温存放24 h稳定。

2.2.5平衡溶解度的测定设定室温25℃和体温37℃的温度条件，取过量鞣花酸原料药于具塞三角瓶中，分别加入“2.1.1”项下配制的pH分别为1.2、2.5、5.8、6.8、7.4、7.8～8.0的系列缓冲液，超声至药物不再溶解，放入25℃恒温振荡器中振摇72 h，直至鞣花酸溶液的溶解度达到平衡状态时取出，于254 nm处测定吸光度，带入相应pH值缓冲液的线性方程。同法测定37℃时鞣花酸在pH 1.2～8.0磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度。室温25℃和体温37℃下，pH为1.2～5.8时，鞣花酸的溶解度均随pH值的升高而增大，pH为6.8～8.0时，其溶解度骤降，这可能与其结构中的弱碱性基团有关，同时表明鞣花酸的平衡溶解度基本不受温度的影响，见表2。

表1　25℃与37℃时不同pH值的标准曲线方程

pH25℃S/(g/mL)RSD/%37℃S/(g/mL)RSD/%1.22.77±0.001.063.25±0.001.092.54.97±0.000.085.08±0.000.425.08.14±0.020.138.04±0.000.725.86.16±0.010.086.39±0.020.266.81.22±0.010.071.02±0.010.347.41.33±0.000.451.54±0.010.37.8~8.01.01±0.010.371.14±0.010.58

2.3油水分配系数的测定

2.3.1线性考察精密吸取鞣花酸储备液0.10、0.12、0.17、0.22、0.27 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得到质量浓度为1.050、1.260、1.785、2.310、2.835 μg/mL的鞣花酸系列标准溶液。采用紫外-可见分光光度法测定A值。以浓度C(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标进行线性回归，得回归方程A=0.255 5C-0.034 1，r=0.998 6。表明鞣花酸质量浓度在1.050～2.835 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

2.3.2油水分配系数的测定取适量的鞣花酸溶解于被磷酸盐饱和的正辛醇溶液中，制成相应的正辛醇溶液，加入pH值为2.5、5.8、6.8、7.4、7.8～8.0的系列缓冲液5 mL作为水相，分别放入25℃和37℃的恒温振荡器中，振摇48 h直至平衡，6 000 r/min离心10 min，分离正辛醇层。精密称取正辛醇层适量，甲醇定容至10 mL容量瓶，用紫外-可见分光光度法分别测定A值，根据“2.2.2”项下标准曲线方程，计算质量浓度，按公式计算鞣花酸的表观油水分配系数(Papp)：

式中m为鞣花酸在正辛醇中的初始质量；m。为振荡平衡后正辛醇中鞣花酸的质量。

结果pH值为1.2～8.0时，鞣花酸的P值均<-2，说明鞣花酸不易透过生物膜，推测其在胃肠道的吸收不会很好。室温25℃和体温37℃条件下鞣花酸油水分配系数相差不明显，说明温度对鞣花酸的Papp值几乎无影响，见表3。

3讨论

溶解度和油水分配系数与许多药物的动力学特征如肠吸收特性、血脑屏障渗透性等密切相关，可预测药物在体内的生物活性、药动学性质等，是剂型设计的重要参数之一。由于药物在正辛醇-水两相的分配系数能较好地模拟药物分子在体内的脂-水分配情况，故正辛醇常用于油水分配系数的测定[6-7]。本研究分别测定了在室温25℃和体温37℃条件下，鞣花酸在不同pH值的磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度和正辛醇/磷酸缓冲液体系中的表观油水分配系数，旨在探索鞣花酸在胃肠道体液环境中的溶解度，为研究其在体内的溶解情况和透过生物膜的能力提供理化依据。

表3　25℃与37℃时鞣花酸的表观油水分配系数(Papp) (±s, n=5)

鞣花酸平衡溶解度实验结果表明，室温25℃和体温37℃条件下鞣花酸平衡溶解度基本无变化，说明温度对鞣花酸的溶解度基本无影响。不同pH值条件下，在酸性溶液中鞣花酸平衡溶解度随pH值的升高而增大，在中性及弱碱性溶液中其溶解度骤然降低，表明在酸性溶液中随着pH值增高鞣花酸的溶解性增加；在中性及弱碱性条件下，鞣花酸的溶解度很小，是因为鞣花酸作为一种难溶性药物，虽然能够在碱性溶液中溶解，但在碱性溶液中不稳定极易析出。

药物只有透过细胞膜的类脂成分，才能被机体吸收，故药物的亲脂性的大小会直接影响药物的吸收程度和速度，以及影响药物的膜渗透性。而药物的脂溶性不仅与药物的分子结构有关，也取决于其所处的pH条件下的分子型比例，分子型比例越大，亲脂性越强[8]。常以lgPapp值表示油水分配系数，一般而言，具有较大油水分配系数的药物更容易穿透细胞膜转运和吸收，亲脂性化合物的lgPapp>0，数值愈大亲脂性愈强；lgPapp<0的化合物属亲水性，数值愈小亲水性愈强。本实验在考察鞣花酸油水分配系数时，对比室温25℃和体温37℃条件下鞣花酸表观油水分配系数基本无差别，说明温度对鞣花酸的表观油水分配系数无影响。在pH值1.2~8.0时，鞣花酸的Papp值均<-2，且无明显规律。说明鞣花酸不易透过生物膜，其在胃肠道的吸收性较差，可能与鞣花酸本身的分子型有关，推测其在体内吸收的透膜方式不仅是简单地被动转运，还可能有主动转运或促进扩散，有待进一步研究。

参考文献：

[1]冯立娟,陶吉寒,尹燕雷,等.石榴功能物质鞣花酸研究进展[J].食品科学,2014,35(23): 325-330.

[2]丁楠,高晓黎.HPLC法测定石榴皮提取物中鞣花酸的含量[J].新疆医科大学学报, 2012,35(6):770-772.

[3]康传哲,张明珠,陈岩,等.10-甲氧基喜树碱平衡溶解度和表观油水分配系数的测定[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(9):133-136.

[4]李素琴,袁其朋,徐健梅,等.鞣花酸的生理功能及工艺开发研究现状[J].天然产物研究与开发,2001,13(5):71-74,79.

[5]国家药典委员会.中国药典2010年版[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录176-177.

[6]卢秀霞,何琳,陈莉,等.灯盏花素的溶解度与油水分配系数的测定[J].广东药学院学报,2011,27(1):1-4.

[7]何琳,丁沐涂,卢秀霞,等.黄芩苷在不同pH值缓冲液中理化常数的测定[J].西北药学杂志,2 012,27(3): 208-211.

[8]朱慧,耿婷,张丽,等.荆芥内酯平衡溶解度和油水分配系数的测定[J].中国中药杂志. 2010, 35(23): 3144-3146.

(本文编辑施洋)

Determination of equilibrium solubility and oil-water partition coefficient of ellagic acid

SHI Yang1,2，SUN Yun2,3，XIE Li2，TIAN Li2,3

(1DepartmentofJournalEditorial,XinjiangMedicalUniversity;2CollegeofTCM,

XinjiangMedicalUniversity；3XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescriptionand

ScienceofFormula,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo determine the equilibrium solubility and the apperent oli/water partion coefficient (Papp) of ellagic acid in different pH phosphate buffer solutions in 25℃ and 37℃. MethodsUltraviolet spectrophotometry was employed to determine the equilibrium solubility of ellagic acid in phosphate buffer solutions of different pH value, and the Pappvalues of ellagic acid were determined by shaking flask. ResultsAt 25℃ the equilibrium solubility of ellagic acid in different phosphate buffer solutions of pH 1.2， 2.5，5.0，5.8，6.8，7.4，7.8-8.0 were 2.77，4.97，8.14，6.16，1.22，1.33，1.01 g/mL，and the Pappvalues of ellagic acid were -3.20，-2.36，-2.49，-2.50，-2.48，-2.37，-2.22 respectively; At 37℃ the equilibrium solubility of ellagic acid in different phosphate buffer solutions of pH 1.2，2.5，5.0，5.8，6.8，7.4，7.8-8.0 were 3.25，5.08，8.04，6.39，1.02，1.54，1.14 g/mL，and the Pappvalues of ellagic acid were -2.38， -2.32， -2.38，-2.41，-2.44，-2.38，-2.18 respectively. ConclusionThe equilibrium solubility of ellagic acid is increasing with pH increases in acidic solution and its solubility is less in neutral and weak alkaline solution. The Pappvalues of ellagic acid were <-2 at the pH range from 1.2 to 8.0, which shows it is not easy to through the biological membrane and the absorption is poor in the gastrointestinal tract. The temperature has little influence on the Pappvalues of ellagic acid.

Keywords：ellagic acid; equilibrium solubility; apperent oli/water partion coefficient

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.005

中图分类号：R943

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)02-0145-04

作者简介：施洋(1984-)，男，硕士，编辑，研究方向：中药民族药活性研究。通信作者：田莉，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中药民族药新制剂研究与开发，E-mail：tianli109@126.com。

基金项目：国家自然科学基金(81260668)；新疆医科大学“ 天山英才工程” 专项(Y0382002)